野黃芩素改善高糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞活化引起的血腦屏障功能障礙

王夢娜，梅茜鈺，陸 賓，徐 紅

(上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海市復(fù)方中藥重點實驗室，中藥標準化教育部重點實驗室，中藥新資源與質(zhì)量標準綜合評價國家中醫(yī)藥管理局重點研究室，上海 201203)

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS) 微血管內(nèi)皮細胞對維持CNS穩(wěn)態(tài)有著至關(guān)重要的作用，也是構(gòu)成血腦屏障(blood brain barrier，BBB) 的關(guān)鍵成分[1]。據(jù)報道，糖尿病進程中的高糖環(huán)境會引起微血管內(nèi)皮功能障礙，會加速許多CNS疾病進程，包括中風、阿爾茨海默病和創(chuàng)傷性腦損傷[2-4]。BBB是由高度特異性的CNS微血管內(nèi)皮細胞組成，許多腦疾病常伴有BBB破壞，進而導(dǎo)致疾病發(fā)展的加劇[5]。在BBB中，緊密連接(tight junctions，TJs) 蛋白主要包括Claudin和Occludin兩大家族，主要功能為連接內(nèi)皮細胞，封閉間隙，在維持血腦屏障功能和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮通透性方面扮演了重要的角色[6]。

野黃芩素(scutellarein)是從燈盞細辛(erigerontis herba)、木蝴蝶(oroxyli semen)等具有抗炎鎮(zhèn)痛中藥中分離鑒定的活性單體成分，具有抗癌、神經(jīng)保護和抗炎等作用[7-9]。有報道發(fā)現(xiàn)，野黃芩素可抑制缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞增殖和血管內(nèi)皮生長因子表達，從而有助于減輕糖尿病微血管并發(fā)癥糖尿病視網(wǎng)膜病的發(fā)生[10]。本研究主要探討野黃芩素對高糖誘導(dǎo)激活神經(jīng)小膠質(zhì)細胞所介導(dǎo)的BBB破損的改善作用。

1 材料

1.1 藥物野黃芩素(scutellarein，純度≥98%)，購自上海益宏生物化工有限公司。

1.2 細胞小鼠腦內(nèi)皮細胞株bEnd.3購自Life Technology(Carlsbad, CA)；小鼠神經(jīng)小膠質(zhì)細胞BV-2得自上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所吳曉俊老師課題組饋贈。

1.3 主要試劑Occludin(貨號sc-133256)、claudin-1(貨號sc-166338) 和claudin-19(貨號sc-390274) 抗體均購自Santa Cruz(CA)；claudin-5(貨號GTX84681) 抗體購自GeneTax(Alton Parkway Irvine, CA)；anti-Rabbit IgG(H+L)(貨號312-005-003) 和anti-Mouse IgG(H+L)(貨號415-005-166) 均購自Jackson ImmunoResearch(West Grove, PA)；酶聯(lián)免疫吸附試驗盒(ELISA) 購自R&D(Minneapolis, MN)；葡萄糖和其他試劑，除非另有說明，均購自Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)。

1.4 主要儀器凝膠成像系統(tǒng)(SYNGENE)，超純水過濾儀(Millipore)，分析天平(METTLER TOLEDO)，酶標儀(Bio-Tech)，低溫離心機(Eppendorf)，-80℃低溫冰箱(Thermo Fish)，超聲波細胞粉碎儀(寧波新芝生物科技公司)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)含10% FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基和RPMI 1640培養(yǎng)基分別用于培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞BV-2和內(nèi)皮細胞bEnd.3，兩種細胞均在5% CO2、37 ℃飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細胞模型建立及藥物處理細胞模型建立：取對數(shù)生長期內(nèi)皮細胞，傳至0.45 μm孔徑的細胞小室中，置小室于24孔板中，在小室中加培養(yǎng)基400 μL，在24孔板中加培養(yǎng)基500 μL，隔天換液，培養(yǎng)1周后于24孔板中鋪入對數(shù)生長期小膠質(zhì)細胞，密度2×104/孔，建立血腦屏障細胞模型。藥物處理：野黃芩素以DMSO溶解，配制成0.1 mol·L-1的母液，按所需濃度以培養(yǎng)基進行稀釋用于后續(xù)實驗，加藥后DMSO終濃度不得超過0.1%。葡萄糖(glucose)、甘露醇(mannitol) 溶解于無血清的DMEM培養(yǎng)基中，溶液用0.22 μm濾膜進行過濾除菌，濃度為0.5 mol·L-1。TNF-α粉末以0.1% BSA溶液溶解，配成濃度20 mg·L-1的母液。

2.3 蛋白電泳實驗取對數(shù)生長期內(nèi)皮細胞，貼壁生長良好后，加入野黃芩素(20、50 μmol·L-1)，保護6 h后加入TNF-α(20 μg·L-1)，孵育18 h后胰蛋白酶消化收細胞沉淀，并制備成蛋白樣本。用SDS-PAGE膠對制備好的蛋白樣本進行電泳，完成后將目標蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜(甲醇活化)上，條帶在TBST溶液(含5%脫脂牛奶)中封閉1 h，然后按實驗需求1 ∶200稀釋抗體claudin-1、claudin-19，1 ∶1 000稀釋抗體occludin、claudin-5，將抗體同條帶一起4 ℃孵育過夜。隔天取出條帶于室溫平衡1 h后，用TBST溶液洗去一抗，快搖洗3次，每次8～10 min，然后與1 ∶3 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，再洗去過量二抗，加入化學(xué)發(fā)光液進行顯像，蛋白條帶用GeneTools圖像分析軟件進行定量。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗取對數(shù)生長期小膠質(zhì)細胞，混懸均勻后傳至96孔板中，密度為2×104個/孔，體系為每孔100 μL。貼壁生長良好后更換新鮮培養(yǎng)基，加入野黃芩素(20、50 μmol·L-1)，孵育6 h后，加入25 mmol·L-1的高濃度葡萄糖和等滲對照甘露醇孵育24 h，收集細胞上清液，離心1 000×g，3 min，吸取上層清液，測定TNF-α含量。具體操作按照試劑盒說明書進行。

2.5 內(nèi)皮細胞跨內(nèi)皮電阻實驗細胞模型建立后，加野黃芩素，終濃度為20、50 μmol·L-1，保護6 h后，① 于24孔板中加入25 mmol·L-1的高濃度葡萄糖和等滲對照甘露醇，共孵育6 h、24 h后測定跨內(nèi)皮細胞電阻(transendothelial electrical resistance，TEER)；② 于24孔板中加入TNF-α(20 μg·L-1)，共孵育6 h、18 h后測定TEER。TEER用Millipore Millicell ERS-2細胞電阻儀進行測量，其計算方法為：單層細胞跨內(nèi)皮電阻(ΔΩcm2)=(樣本小室電阻值-空白小室電阻值) ×單層細胞面積。

2.6 內(nèi)皮細胞滲漏實驗細胞模型建立后，在24孔板中加入野黃芩素，終濃度為20、50 μmol·L-1，保護6 h后，于24孔板中加入25 mmol·L-1的高濃度葡萄糖和等滲對照甘露醇孵育24 h，或者加入TNF-α(20 μg·L-1) 孵育18 h，加異硫氰酸熒光素標記葡聚糖(fluorescein isothiocyanate isomer-dextran，F(xiàn)ITC-dextran)(終濃度100 mg·L-1)孵育4 h，收集細胞小室以及24孔板內(nèi)培養(yǎng)基，測熒光值(激發(fā)光485±20 nm，發(fā)射光538±20 nm)。FITC-dextran滲漏值計算方法如下：滲漏值/%=24孔板內(nèi)培養(yǎng)基FITC-dextran熒光值/(24孔板內(nèi)培養(yǎng)基FITC-dextran熒光值+小室內(nèi)培養(yǎng)基FITC-dextran熒光值)×100%。

3 結(jié)果

3.1 野黃芩素對高糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞后內(nèi)皮細胞屏障功能的影響如Fig 1 所示，與空白對照組相比，小膠質(zhì)細胞BV-2用高糖誘導(dǎo)6 h、24 h后，共同培養(yǎng)的細胞小室中內(nèi)皮細胞bEnd.3的跨膜電阻值明顯下降(P<0.01)，而給予不同劑量野黃芩素(20、50 μmol·L-1) 預(yù)孵育可逆轉(zhuǎn)下降的電阻值(P<0.05,P<0.01)，同時等滲對照甘露醇組以及不給予高糖誘導(dǎo)而只與小膠質(zhì)細胞BV-2共培養(yǎng)組其電阻值均未產(chǎn)生明顯變化。如Fig 2所示，與空白對照組相比，小膠質(zhì)細胞BV-2與內(nèi)皮細胞bEnd.3共培養(yǎng)時，小膠質(zhì)細胞BV-2用高糖誘導(dǎo)24 h后，細胞小室中FITC標記葡聚糖穿過內(nèi)皮細胞bEnd.3構(gòu)成的單細胞層進入24孔板的滲漏量明顯升高(P<0.01)，而給予不同劑量的野黃芩素(20、50 μmol·L-1)均可逆轉(zhuǎn)升高的滲漏量(P<0.01)，同時等滲對照甘露醇組以及不給高糖誘導(dǎo)而只與小膠質(zhì)細胞bEnd.3共培養(yǎng)組的滲漏量均未產(chǎn)生明顯變化。

Fig 1 Effect of scutellarin on TEER of cross-endothelial cell bEnd.3 after HG induced microglia **P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs HG group.

Fig 2 Effect of scutellarin on FITC-dextran permeability of bEnd.3 after BV-2 induced by **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs HG group.

3.2 野黃芩素對高糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞上清液中TNF-α含量的影響如Fig 3所示，與空白對照組相比，小膠質(zhì)細胞BV-2用高糖誘導(dǎo)24 h后，細胞上清液中TNF-α的含量明顯增加(P<0.05)，而給予不同劑量野黃芩素(20、50 μmol·L-1)可逆轉(zhuǎn)增加的TNF-α含量(P<0.05,P<0.01)，同時等滲對照甘露醇組的TNF-α含量未產(chǎn)生明顯變化。

3.3 野黃芩素對TNF-α誘導(dǎo)后內(nèi)皮細胞屏障功能的影響如Fig 4所示，與空白對照組相比，內(nèi)皮細胞bEnd.3給予TNF-α刺激6 h、18 h后，其跨膜電阻值明顯下降(P<0.01)，而給予不同濃度的野黃芩素(20、50 μmol·L-1)后均可逆轉(zhuǎn)由TNF-α導(dǎo)致的跨膜電阻值下降(P<0.01)。如Fig 5所示，與空白對照組相比，內(nèi)皮細胞bEnd.3給予TNF-α刺激18 h后，F(xiàn)ITC-dextran滲漏值亦明顯升高(P<0.01)，而給予野黃芩素(20、50 μmol·L-1)后可抑制其滲漏的增加(P<0.05,P<0.01)。

Fig 3 Effect of scutellarin on TNF-α content in supernatant of bEnd.3 induced by *P<0.05 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs HG group.

Fig 4 Effect of scutellarin on TEER of bEnd.3 **P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs model group.

3.4 野黃芩素對TNF-α誘導(dǎo)后內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白表達的影響如Fig 6所示，與空白對照組相比，內(nèi)皮細胞bEnd.3給予TNF-α刺激18 h后，其claudin-1、claudin-5和claudin-19的蛋白表達均明顯減少(P<0.05)，而給予不同濃度的野黃芩素(20、50 μmol·L-1) 后claudin-1、claudin-19的蛋白表達均明顯被逆轉(zhuǎn)(P<0.05)。

Fig 5 Effect of scutellarin on FITC-dextran permeability of bEnd.3 induced by **P<0.01 vs control group;#P<0.05,##P<0.01 vs model group.

Fig 6 Effect of scutellarin on expression of tight junction protein in bEnd.3 induced by *P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs model group.

4 討論

已有研究表明，糖尿病狀態(tài)下持續(xù)的高血糖會破壞BBB的完整性，增加CNS微血管的通透性，這些改變是引起糖尿病CNS并發(fā)癥的主要原因之一[11]。目前關(guān)于糖尿病如何影響B(tài)BB的研究報道并不是很多，其具體機制有待進一步研究。在CNS中，小膠質(zhì)細胞是長期存在的免疫細胞，據(jù)報道其激活與各種CNS疾病(如中風、阿爾茨海默病等) 的發(fā)展進程密切相關(guān)[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病狀態(tài)下，高糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞激活所介導(dǎo)的炎性反應(yīng)會對血視網(wǎng)膜屏障造成明顯的損傷[13]，但是否會對BBB也造成損傷尚不清楚。本研究將高糖誘導(dǎo)激活的小膠質(zhì)細胞同內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)后，采用TEER實驗和FITC-dextran滲漏法進行檢測，發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)活化的小膠質(zhì)細胞可以在體外對內(nèi)皮細胞屏障造成明顯的損傷，提示糖尿病狀態(tài)下激活的神經(jīng)小膠質(zhì)細胞會導(dǎo)致BBB的破損。進一步研究發(fā)現(xiàn)，野黃芩素明顯逆轉(zhuǎn)了高糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞活化所介導(dǎo)的BBB損傷。

TNF-α是活化的小膠質(zhì)細胞釋放的主要促炎性細胞因子之一，有報道發(fā)現(xiàn)，TNF-α可誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙，破壞CNS穩(wěn)態(tài)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)野黃芩素可抑制體外高糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞BV-2中促炎性細胞因子TNF-α的釋放。進一步研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可在體外腦血管內(nèi)皮細胞bEnd.3上引起內(nèi)皮細胞屏障的破壞，而野黃芩素能逆轉(zhuǎn)TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞屏障破損。這些結(jié)果提示，神經(jīng)小膠質(zhì)細胞可以在糖尿病狀態(tài)下經(jīng)持續(xù)高糖刺激后被誘導(dǎo)激活，釋放炎性因子如TNF-α，造成BBB的損傷。野黃芩素既可以抑制高糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞活化從而降低TNF-α的釋放，也可以逆轉(zhuǎn)炎性細胞因子TNF-α所誘導(dǎo)的BBB破損。

TJs蛋白主要由與肌動蛋白細胞骨架相連的跨膜(junctional adhesion molecules，occludin and claudins)和胞質(zhì)蛋白(zonula occludens-1 and-2)組成，TJs的完整性對維持BBB的正常功能至關(guān)重要[15]。已有研究表明，促炎性細胞因子，如TNF-α和IL-1，可引起TJs的改變，并導(dǎo)致BBB損傷[16]。claudin-1、claudin-5和claudin-19是典型的TJs蛋白，在BBB中表達豐富，其表達降低與缺血性腦卒中、阿爾茲海默病的發(fā)生有關(guān)[17-18]。在本研究中，TNF-α可以誘導(dǎo)claudin-1、claudin-5和claudin-19蛋白在腦血管內(nèi)皮細胞bEnd.3中表達明顯降低，而野黃芩素逆轉(zhuǎn)了claudin-1、claudin-19蛋白表達的降低，但是不能逆轉(zhuǎn)claudin-5蛋白表達的降低。同時TNF-α沒有影響腦血管內(nèi)皮細胞bEnd.3中occludin蛋白的表達，而野黃芩素也對其表達沒有任何影響。上述結(jié)果提示，野黃芩素在一定程度上可通過逆轉(zhuǎn)TNF-α誘導(dǎo)的TJs蛋白如claudin-1、claudin-19表達的下調(diào)，維持BBB的完整性。

總之，本文的研究結(jié)果表明，天然產(chǎn)物野黃芩素可以保護BBB免受高糖誘導(dǎo)激活的小膠質(zhì)細胞所介導(dǎo)的損傷。其作用機制可能是野黃芩素降低了小膠質(zhì)細胞中TNF-α等促炎性細胞因子的表達，并通過維持TJs的完整性，逆轉(zhuǎn)了促炎性因子TNF-α誘導(dǎo)的BBB損傷。這項研究表明野黃芩素對糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥具有潛在的治療作用。