血小板內(nèi)皮黏附分子-1與表皮生長(zhǎng)因子受體在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌中表達(dá)的關(guān)系及意義

司惠妍，李靖若，呂思琦，李文龍，張瑩瑩

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 乳腺外科，河南 鄭州 450052)

如今，乳腺癌已成為威脅我國(guó)女性健康的首位惡性腫瘤，發(fā)病率連年上升，發(fā)病年齡趨于年輕化，乳腺惡性腫瘤是乳腺上皮細(xì)胞在多種因素的共同作用下異常增殖而最終形成的。對(duì)乳腺癌組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)及分析是目前乳腺癌診療的基本步驟之一，它影響著進(jìn)一步治療方案的制定以及預(yù)后的判定。臨床研究發(fā)現(xiàn)，血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，又稱CD31)是相對(duì)分子質(zhì)量為130 kD的免疫球蛋白超家族成員之一，主要存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接處，與內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能密切相關(guān)，它參與了細(xì)胞的黏附、外滲，影響著多種信號(hào)通路的表達(dá)。另外，CD31也影響了腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)中整合素的結(jié)合，抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡[1]。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是相對(duì)分子質(zhì)量為180 kD的酪氨酸激酶受體家族成員之一，常存在于細(xì)胞膜表面，有酪氨酸激酶活性，影響細(xì)胞外信號(hào)向胞內(nèi)傳遞的過(guò)程，刺激乳腺癌細(xì)胞分裂增殖[2]。近年來(lái)一些研究發(fā)現(xiàn)CD31和EGFR在乳腺癌組織中異常表達(dá)，但有關(guān)二者之間聯(lián)系的文獻(xiàn)卻很少[3-4]。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)乳腺癌組織中CD31與EGFR表達(dá)情況，探討它們與乳腺癌分子分型、細(xì)胞增殖核抗原(Ki-67)的表達(dá)及其他生物學(xué)行為之間的關(guān)系，為乳腺癌的診療及判斷預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2017年10月至2019年10月間就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科原發(fā)性乳腺癌患者163例，術(shù)后病理均為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，患者均為女性，年齡為27～83歲，中位年齡為50歲。術(shù)前均未接受化療、放射治療及內(nèi)分泌治療。按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)于2017年發(fā)布的乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅰ期56例，Ⅱ期95例，Ⅲ期11例，Ⅳ期1例；腫瘤直徑>2 cm有79例，≤2 cm有84例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移73例，無(wú)轉(zhuǎn)移90例。參照中國(guó)臨床腫瘤協(xié)會(huì)于2019年發(fā)布的乳腺癌分子分型標(biāo)準(zhǔn)，分為L(zhǎng)uminal A型41例，Luminal B型41例，三陰型40例，Her-2陽(yáng)性型41例。Ki-67<30% 74 例，Ki-67≥30% 89例。

1.2 試劑鼠抗人CD31單克隆抗體(66065-1-Ig)、鼠抗人EGFR單克隆抗體(66455-1-Ig)均購(gòu)自武漢三鷹公司，Ki-67增殖檢測(cè)試劑盒、SP超敏免疫組化試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法163例乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者均接受手術(shù)治療，利用免疫組織化學(xué)SP染色方法檢測(cè)術(shù)中獲取的乳腺癌組織中CD31、EGFR及Ki-67表達(dá)情況。首先將標(biāo)本置于中性甲醛固定，后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，烤片。石蠟常規(guī)脫蠟水化，用PBS緩沖液沖洗3次，檸檬酸鈉抗原修復(fù)液修復(fù)，過(guò)氧化氫溶液消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，滴加正常山羊血清封閉液，室溫靜置20 min，甩去多余液體。滴加Ⅰ抗50 μL，室溫靜置1 h，滴加鼠抗人CD31抗體及鼠抗人EGFR抗體室溫下孵育30 min。進(jìn)行DAB顯色8～12 min后用蒸餾水沖洗，脫水、透明、以中性樹(shù)膠封固，鏡下觀察。陰性對(duì)照以磷酸鹽緩沖液PBS代替一抗，陽(yáng)性對(duì)照為同樣條件下已知的陽(yáng)性切片。

1.4 結(jié)果判定CD31及EGFR陽(yáng)性表達(dá)為在組織中出現(xiàn)棕黃色染色，即在高倍鏡(×200)下隨機(jī)取5個(gè)不同的視野，觀察染色數(shù)量及程度，CD31、EGFR染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>10%為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定性資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析使用Spearman秩相關(guān)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中CD31與EGFR蛋白表達(dá)及二者的關(guān)系163例乳腺癌組織中，共有91例CD31表達(dá)陽(yáng)性(55.8%)，棕黃色顆粒主要定位于血管內(nèi)皮的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜處，66例EGFR表達(dá)陽(yáng)性(40.5%)，棕黃色顆粒主要定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。二者陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.155，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中CD31、EGFR蛋白表達(dá)陽(yáng)性率與臨床生物學(xué)特征的關(guān)系CD31陽(yáng)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較CD31陰性高，CD31在Ki-67≥30%、三陰型組織中陽(yáng)性表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EGFR蛋白在腫塊最大徑>2 cm、組織學(xué)分型Ⅲ級(jí)、Ki-67≥30%、三陰型組織中陽(yáng)性表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

A為CD31在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)；B為EGFR在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)；CD31為血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子-1；EGFR為表皮生長(zhǎng)因子受體。

圖1 CD31和EGFR在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)(DAB，×200) 表1 乳腺癌組織中CD31、EGFR陽(yáng)性表達(dá)率與臨床生物學(xué)特征的關(guān)系[n(%)]

3 討論

乳腺腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育是在多種因素的共同作用下完成的，而乳腺腫瘤血管的生成是乳腺癌細(xì)胞增殖分化、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要影響因素之一。CD31參與并調(diào)節(jié)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的病理活動(dòng)，當(dāng)血小板與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，內(nèi)皮細(xì)胞與CD31連接，促使并增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞與乳腺腫瘤細(xì)胞的粘連[5]。另外，CD31常與其他黏附分子共同被激活，產(chǎn)生大量生長(zhǎng)因子降解微血管膜，使乳腺腫瘤細(xì)胞開(kāi)始浸潤(rùn)并移動(dòng)，乳腺癌組織周?chē)律苌?，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤(rùn)并遷移[6]。在以往的研究中，CD31作為血管內(nèi)皮標(biāo)志物，可以反映前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌等惡性腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)育，為它們確定診療方法、判斷預(yù)后做出巨大貢獻(xiàn)。Bergom等[7-10]研究指出，胃腸道間質(zhì)瘤的增殖發(fā)展及預(yù)后與CD31表達(dá)有關(guān)。在本研究中，CD31蛋白在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移、Ki-67高表達(dá)、三陰型的組織中陽(yáng)性表達(dá)較高。乳腺癌的常見(jiàn)轉(zhuǎn)移方式有局部浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血液轉(zhuǎn)移，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在臨床中最為多見(jiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD31與乳腺癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并且這一過(guò)程需要來(lái)自周?chē)律艿臓I(yíng)養(yǎng)支持，CD31陽(yáng)性表達(dá)，乳腺癌腫瘤臨床分期可能越晚。另外，既往研究顯示，三陰型乳腺癌是指雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長(zhǎng)因子受體2均為陰性的乳腺癌，其分化程度較低，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率及惡性程度較高，患者總體存活時(shí)間較短。本研究結(jié)果提示了新生血管的形成及CD31陽(yáng)性表達(dá)與乳腺癌組織的分子分型和三陰型乳腺癌的上述特點(diǎn)相關(guān)。

EGFR是酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族成員之一，有酪氨酸激酶活性，主要通過(guò)基因突變或者基因擴(kuò)增兩種方式激活，其活化、表達(dá)、突變對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、變異凋亡和周?chē)律艿男纬捎兄匾淖饔肹11]，EGFR蛋白表達(dá)及信號(hào)通路的增強(qiáng)也提示了乳腺腫瘤的預(yù)后不良[12-13]。本研究中，EGFR蛋白在較大腫塊、組織學(xué)分型較高、Ki-67高表達(dá)、三陰型組織中陽(yáng)性表達(dá)率較高，說(shuō)明有著酪氨酸激酶作用特點(diǎn)的EGFR，在乳腺癌腫瘤尤其是三陰型乳腺癌的生長(zhǎng)發(fā)育及分化進(jìn)程中起重要作用，EGFR陽(yáng)性表達(dá)，腫瘤越大，分期越晚。

在本研究中，CD31和EGFR在乳腺癌組織特別是三陰型乳腺癌組織中高表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)表明二者之間有一定的相關(guān)性，說(shuō)明在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌新生血管的形成及腫瘤的生發(fā)轉(zhuǎn)移過(guò)程中CD31與EGFR密不可分，互相促進(jìn)，相輔相成，協(xié)同作用，但其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖代謝、遷移轉(zhuǎn)移涉及多個(gè)基因的改變，EGFR和CD31這兩種蛋白則可作為判斷乳腺癌生長(zhǎng)發(fā)育程度、侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，對(duì)臨床診斷及判定預(yù)后有著重要指導(dǎo)作用，也可成為今后臨床治療尤其是靶向治療的新方向。