基于響應(yīng)面的成品露酒勾調(diào)及體外抗氧化研究

王 廣，朱定國(guó)，，余愛(ài)民，程宏連，程 超

(1.湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施 445000；2.恩施硒谷科技股份有限公司，湖北恩施 445000；3.重慶市酒類(lèi)管理協(xié)會(huì)，重慶 404100)

中國(guó)除了茶飲之外，大概再?zèng)]有一種液體能夠像酒一樣讓人嗜之若命，也再?zèng)]有一樣食品能夠像中國(guó)酒一樣與中華上下五千年文化一同源遠(yuǎn)流長(zhǎng)。隨著社會(huì)的不斷前進(jìn)、發(fā)展，中國(guó)酒也在不斷地適應(yīng)新的變化。從發(fā)酵酒到蒸餾酒再到露酒，從液態(tài)法發(fā)酵到固態(tài)法發(fā)酵，從高度化、烈性化、大眾化到低度化、健康化、定制化等等，無(wú)不反映著中國(guó)酒的發(fā)展歷程。在這一系列變化中尤以露酒最為明顯，露酒作為中國(guó)酒里面重要的一種，有著舉足輕重的地位。本文的復(fù)合型露酒主要以綿柔型小曲白酒為基酒[1]，桂花、絞股藍(lán)、藤茶為主要浸泡物，它不僅具備基酒所含有的酸、酯、醛、醇等多種物質(zhì)[2-3]，并且擁有擴(kuò)張血管、降低顱內(nèi)壓力、降低膽固醇、預(yù)防心血管疾病等藥理功效[4-7]，此外，被浸泡物亦具備舒適的揮發(fā)油香氣[8-10]，富含黃酮、多酚、皂甙、多糖等[11-15]，具有抗氧化[16-18]，降血糖、血脂[19-21]，延緩衰老[22-24]，抗菌、消炎等諸多功效[25-28]，及其他營(yíng)養(yǎng)功能。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品及耗材：綿柔型小曲白酒，恩施巴王酒業(yè)有限公司；藤茶（優(yōu)級(jí)），湖北仙芝堂生物科技有限公司；絞股藍(lán)（優(yōu)級(jí)），湖北仙芝堂生物科技有限公司；桂花（優(yōu)級(jí)），湖北仙芝堂生物科技有限公司；冰糖，上海財(cái)源來(lái)糖業(yè)有限公司；無(wú)水檸檬酸（食品級(jí)），濰坊英軒實(shí)業(yè)有限公司。

試劑：水楊酸（AR 級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵（AR級(jí)），天津市福晨化學(xué)試劑有限公司；30%過(guò)氧化氫（AR級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二水合磷酸氫二鈉（AR級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二水合磷酸二氫鈉（AR級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇（AR級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；過(guò)二硫酸鉀（AR級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ABTS（色譜級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH（色譜級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-9000S），上海元析儀器有限公司；電子天平（d=0.1 mg），賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；酒度計(jì)（0～100），德州潤(rùn)昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；超純水設(shè)備，武漢品冠儀器設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋（SG），上海蘇豪智能系統(tǒng)有限公司；超聲波清洗儀（30 L），上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司；Design-Expert 軟件，8.0.5b版本。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)流程（圖1）

1.2.2 實(shí)驗(yàn)操作關(guān)鍵點(diǎn)

（1）實(shí)驗(yàn)的露酒原酒配方主要以前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，并同時(shí)結(jié)合浸泡產(chǎn)生的露酒感官品評(píng)（為主）而確定的配方。

（2）勾調(diào)時(shí)對(duì)露酒原酒先進(jìn)行自然澄清操作；冰糖先配制成30.00%（m/v）溶液后再添加；檸檬酸配制成10.00%（m/v）溶液后添加。

（3）勾調(diào)配方過(guò)程中保證露酒原酒和調(diào)味劑比例（冰糖、檸檬酸）均以總體積確定，不足部分用蒸餾水補(bǔ)足100%。

（4）單因素試驗(yàn)及成品露酒評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以感官品評(píng)為準(zhǔn)（100 分制），為避免誤差將最低分控制在75分以上，最終得分為平均分。

（5）感官品評(píng)環(huán)境為：溫度16～26 ℃，濕度40%～70%，噪聲小于40 dB，燈光色溫6500 K，品酒杯容量50～55 mL、最大液面處容量15～20 mL的郁金香杯，品酒時(shí)間上午9:00—11:00。

1.2.3 優(yōu)化配方的單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 冰糖用量?jī)?yōu)化試驗(yàn)

基酒用量為50.00%，檸檬酸用量0.05%，冰糖添加量為2.00%、4.00%、6.00%、8.00%、10.00%。

1.2.3.2 基酒用量單因素試驗(yàn)

檸檬酸用量為0.05 %、冰糖用量為6.00 %，基酒用量為30.00 %、40.00 %、50.00 %、60.00 %、70.00%。

1.2.3.3 檸檬酸用量?jī)?yōu)化試驗(yàn)

冰糖用量為6.00 %、基酒用量為50.00%，檸檬酸添加量為0.03 %、0.04 %、0.05 %、0.06 %、0.07%。

1.2.4 配方的響應(yīng)面優(yōu)化

依據(jù)1.2.3 中單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件（Design Expert）生成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)表1，成品配方響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平。

表1 Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)因素及水平

1.2.5 復(fù)合露酒對(duì)DPPH自由基的清除作用

配制2 mmol/L 的DPPH 溶液備用；將樣品稀釋為100 倍、500 倍、1000 倍、1500 倍、2000 倍后備用。取5 支潔凈的帶塞試管，依次加入2.00 mL 不同稀釋濃度的樣品溶液、2.00 mL DPPH 溶液，混合均勻后避光靜置30 min，然后在517 nm 測(cè)定吸光度值，DPPH自由基的清除率按照公式1計(jì)算[29]。

式中：Ac——2.00 mL DPPH 溶液+2.00 mL 無(wú)水乙醇溶液在517 nm處的吸光度值。

Ai——2.00 mL樣品溶液+2.00 mL DPPH溶液在517 nm處的吸光度值。

Aj——2.00 mL 樣品溶液+2.00 mL 無(wú)水乙醇溶液在517 nm處的吸光度值。

1.2.6 復(fù)合露酒對(duì)ABTS+·自由基的清除作用

ABTS+·儲(chǔ)備溶液制備：取5.00 mL 7 mmol 的ABTS+·溶液、88.00 μ L 140 mmol 的過(guò)硫酸氫鉀，混合均勻，避光貯存過(guò)夜，得ABTS+·儲(chǔ)備液，使用前用45%vol 乙醇稀釋至734 nm 吸光度值為0.70±0.02。

樣品測(cè)定：將待測(cè)樣品依次稀釋為500 倍、1000 倍、1500 倍、2000 倍、2500 倍后備用；取潔凈的帶塞試管，依次加入1.00 mL 稀釋的樣品、3.00 mL ABTS+·儲(chǔ)備溶液，混合均勻、反應(yīng)6 min后在734 nm處測(cè)定其吸光度值[29]。并按照公式2 計(jì)算ABTS+·的清除率。

式中：A0——1.00 mL 緩沖溶液+3.00 mL ABTS+·溶液在734 nm處的吸光度值。

A1——1.00 mL 樣品溶液+3.00 mL ABTS+·溶液在734 nm處的吸光度值。

A2——1.00 mL 樣品溶液+3.00 mL 緩沖溶液在734 nm處的吸光度值。

1.2.7 復(fù)合露酒對(duì)·OH自由基的清除作用

溶液制備：9 mmol 硫酸亞鐵的制備，精確稱(chēng)取2.50 g 的硫酸亞鐵并定容到1 L，備用；9 mmol 水楊酸的制備，精確稱(chēng)取1.243 g 的水楊酸，并用無(wú)水乙醇溶解、定容到1 L，備用；8.8 mmol 的過(guò)氧化氫溶液制備，量取0.90 mL 的30 %過(guò)氧化氫溶液于1 L棕色容量瓶中，并定容備用。

樣品測(cè)定，按照表2 依次加入樣品及反應(yīng)溶劑，于37 ℃條件下進(jìn)行水浴15 min，然后于700 nm處測(cè)定吸光度值[29]，并按照公式3 計(jì)算·OH 的清除率。

式中：Az——空白組在700 nm處的吸光度值。

Ax——樣品組在700 nm處的吸光度值。

AY——不加過(guò)氧化氫組在700 nm處的吸光度值。

1.2.8 露酒的品評(píng)判定標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27588—2011《露酒》、GB/T 33404—2016《白酒感官品評(píng)導(dǎo)則》、GB/T 33405—2016《白酒感官品評(píng)術(shù)語(yǔ)》、GB/T 33406—2016《白酒風(fēng)味物質(zhì)閾值測(cè)定指南》、GB 2757—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)蒸餾酒及其配制酒》《白酒生產(chǎn)技術(shù)全書(shū)》（中國(guó)輕工業(yè)出版社/沈怡方著）、《白酒品酒師手冊(cè)》（中國(guó)輕工業(yè)出版社/賴(lài)高淮著）等專(zhuān)業(yè)文件及書(shū)籍制定評(píng)分判定表格，由1 名國(guó)家白酒評(píng)委、3 名省級(jí)白酒評(píng)委及10 名普通消費(fèi)者進(jìn)行盲評(píng)打分（其中國(guó)家評(píng)委評(píng)分比重占40%，省級(jí)評(píng)委評(píng)分比重占30 %，普通消費(fèi)者30 %，總分100分），其復(fù)合型露酒感官定量評(píng)分表及對(duì)應(yīng)的露酒風(fēng)味輪見(jiàn)表3和圖2。

表2 ·OH體外抗氧化體系測(cè)定表(mL)

表3 復(fù)合型露酒感官定量評(píng)分表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，成品露酒的勾調(diào)實(shí)驗(yàn)中，品評(píng)得分最高分分別出現(xiàn)在糖含量為4.00%到糖含量為8.00 %的區(qū)間；酸用量則在0.04 %到0.06 %之間；基酒用量在50.00 %到60.00 %之間（圖3）。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)配方由軟件（Design-Expert）自動(dòng)生成，其配方品評(píng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4；響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析見(jiàn)表5；響應(yīng)面各因素對(duì)品評(píng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果3D效果圖見(jiàn)圖4、圖5、圖6。

表4 Box-Behnken Design響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

以品評(píng)得分為響應(yīng)值，利用Design-Expert 軟件可擬合出3 個(gè)影響因素的回歸方程為：品評(píng)分=84.70+0.45A+1.20B-2.40C+0.10AB-0.90BC-0.75A2-2.95B2-1.35C2。通過(guò)Design-expert 軟件分析可得出，此方程R=0.928，說(shuō)明此方程可很好反映3個(gè)影響因素對(duì)露酒品評(píng)分的影響。利用軟件分析可得出露酒最佳配方A 為1、B 為0.35、C 為-0.97 水平，即基酒比例為60.00 %，冰糖用量為6.70 %，檸檬酸用量為0.04%。

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析

以預(yù)測(cè)的配方組合制備露酒，具體見(jiàn)圖7。所得到的復(fù)合型露酒顏色橙黃清亮，具有桂花與絞股藍(lán)復(fù)合香氣且香氣舒適、濃郁，口味馥郁，回味具有藤茶特有的甘苦感，綜合酒精度在25%vol，典型風(fēng)格突出的特點(diǎn)。

2.3 抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)該成品酒進(jìn)行體外不同的抗氧化體系（DPPH 體系、ABTS+·體系、·OH 自由基體系）實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。

通過(guò)圖8可以發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)體外抗氧化體系均呈現(xiàn)隨著成品酒被稀釋的倍數(shù)越大，酒的體外抗氧化能力（清除率）越低的趨勢(shì)，其中對(duì)于DPPH 自由基體外抗氧化體系，其體外抗氧化能力在樣品被稀釋100 倍和500 倍時(shí)，分別為92.44%和77.00%，但是當(dāng)樣品稀釋倍數(shù)為1000 倍以上時(shí)，樣品對(duì)DPPH 自由基的體外抗氧化能力在30%以下；針對(duì)ABTS 體外抗氧化體系，體外抗氧化能力在樣品被稀釋1000倍以上時(shí)小于50 %，但是同樣是樣品被稀釋1000倍和2000 倍時(shí)，ABTS 體系的體外抗氧化能力分別為52.48 %和30.86 %，均高于DPPH 自由基體系的29.75%和15.35%；對(duì)于OH 自由基體系而言，樣品被稀釋倍數(shù)大于20 倍時(shí)，其體外抗氧化能力為56.52 %，當(dāng)稀釋倍數(shù)逐漸增加為100 倍時(shí)，體外抗氧化能力為30.89%。

3 小結(jié)

通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得出最優(yōu)的復(fù)合型露酒的配方：基酒比例為60.00 %，冰糖用量為6.70 %，檸檬酸用量為0.04%（水補(bǔ)足100%），以此配方制備的成品露酒具有酒精度低，易入口、桂花香馥郁，口感回甘等一系列特點(diǎn)。通過(guò)對(duì)該成品露酒的不同體系體外抗氧化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合型露酒對(duì)ABTS+·、DPPH 和·OH 具有較強(qiáng)的清除作用。且有以下幾點(diǎn)思考及說(shuō)明：

（1）該成品酒基于響應(yīng)面法的配方選定實(shí)驗(yàn)中，消費(fèi)者盲評(píng)小組年齡在25～30 歲之間，在口感上均偏向于苦味較小的配方（這一點(diǎn)可以由響應(yīng)面結(jié)果的3D 圖直觀反映出來(lái)），而專(zhuān)業(yè)評(píng)委則偏向酒度偏高、香味馥郁的配方組，如何建立兩者之間的平衡紐帶，是我們下一步研究的重點(diǎn)。另限于地理?xiàng)l件，該成品酒沒(méi)有在更大范圍內(nèi)進(jìn)行盲評(píng)，考慮到酒具有一定的地域性，所以該復(fù)合型成品露酒的后續(xù)研究將偏向于地域適應(yīng)性方面。

（2）實(shí)驗(yàn)中的原材料，尤其是基于恩施本地的藤茶和絞股藍(lán)，材料本身不僅對(duì)人體具有抗氧化、清除自由基的生物活性成分（黃酮、多酚、皂甙、多糖等），而且由于恩施特殊的地理位置（國(guó)內(nèi)唯一探明的獨(dú)立硒礦床），極有可能還富含富硒的各種大分子物質(zhì)。諸如硒多糖、硒多肽等，這方面的研究可以作為一個(gè)全新的子課題。

（3）對(duì)于該復(fù)合型成品露酒的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中采取了不同的稀釋濃度，但是在實(shí)際生產(chǎn)中及消費(fèi)中，該復(fù)合型露酒不會(huì)再被稀釋?zhuān)匆猿善沸吐毒浦苯语嬘茫运捏w外抗氧化能力應(yīng)該分別高于90 %（DPPH 體系）、80 %（ABTS+·體系）和86 %（·OH 自由基體系），同時(shí)由于該成品露酒暫不定位于保健品及其不可能長(zhǎng)期大量飲用的習(xí)慣，所以未進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)，同時(shí)該成品酒的體外抗氧化能力分別由被浸泡物（桂花、藤茶和絞股藍(lán)）和調(diào)味劑（檸檬酸）貢獻(xiàn)多少，尚待進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)研究。

（4）該成品露酒基于恩施地區(qū)富硒特性的研究以及以此建立其特征圖譜有待于下一步研究，同時(shí)該實(shí)驗(yàn)中的復(fù)合型露酒原酒生產(chǎn)工藝因涉及到專(zhuān)利知識(shí)產(chǎn)權(quán)，不便公開(kāi)，敬請(qǐng)諒解。