多殺菌素影響下黑斑側(cè)褶蛙皮膚轉(zhuǎn)錄組分析

王愛(ài)麗 李娜 王金園 聶茂菊

（濰坊科技學(xué)院，山東壽光 262700）

0 引言

多殺菌素（Spinosad），又名刺糖菌素，是由好氧型革蘭氏陽(yáng)性土壤放線菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）發(fā)酵液中提取的一種大環(huán)內(nèi)酯類無(wú)公害高效生物殺蟲(chóng)劑，沒(méi)有抑菌活性，但有殺蟲(chóng)活性。其具有獨(dú)特的殺蟲(chóng)機(jī)理，能夠有效地防治各種害蟲(chóng)，且無(wú)交叉抗性，對(duì)大多非靶標(biāo)動(dòng)物都有極高的安全性等優(yōu)點(diǎn)，且多殺菌素可較快地通過(guò)光和土壤微生物降解，因而不會(huì)造成環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。由于多殺菌素具有上述優(yōu)點(diǎn)，所以，多殺菌素在蔬菜種植區(qū)應(yīng)用廣泛[1]。

黑斑側(cè)褶蛙（Pelophylax nigromaculata），又名黑斑蛙，屬無(wú)尾目，蛙科，側(cè)褶蛙屬，是山東壽光地區(qū)常見(jiàn)蛙類之一。因其清晨及夜間大量捕食斜紋夜蛾、螻蛄、金花蟲(chóng)等昆蟲(chóng)，而成為經(jīng)濟(jì)價(jià)值較大的蛙類之一[2]。黑斑側(cè)褶蛙水陸兩生環(huán)境復(fù)雜，對(duì)環(huán)境的依賴性大，環(huán)境的變化對(duì)他們的生長(zhǎng)和進(jìn)化都會(huì)產(chǎn)生很大的影響。本文擬對(duì)經(jīng)過(guò)多殺菌素處理的皮膚組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，找出差異基因顯著富集的通路，預(yù)測(cè)多殺菌素對(duì)黑斑側(cè)褶蛙皮膚的功能影響。

1 材料和方法

1.1 樣品處理和RNA 提取

本試驗(yàn)樣品采集于山東省煙臺(tái)市昆崳山。黑斑側(cè)褶蛙10 只分成2 組，每組5 只標(biāo)記養(yǎng)殖，其中對(duì)照組標(biāo)記為c，處理組標(biāo)記為n。處理組為用2.5%懸浮劑50 ～100 毫升稀釋多殺菌素溶液噴霧進(jìn)行刺激的黑斑側(cè)褶蛙。對(duì)照組和處理組在完全相同的環(huán)境中生長(zhǎng)，48 小時(shí)后搗毀脊髓法處理，取背部中央皮膚液氮保存?zhèn)溆?。分別測(cè)定6 只黑斑側(cè)褶蛙皮膚轉(zhuǎn)錄組信息，序列比對(duì)，差異基因，差異抗菌肽分析。同時(shí)確定黑斑側(cè)褶蛙轉(zhuǎn)錄組序列發(fā)生改變的多殺菌素濃度為有效刺 激 濃 度。總RNA 用TRIzol（Invitgen，Carlsbad，CA，USA） 試 劑 提 取，260/280nm（A260/A280）和Agilent BioAnalyzer 2100（Agilent，上海，中國(guó)）測(cè)量吸光度來(lái)檢測(cè)RNA 樣品的完整性和質(zhì)量。

李偉：順豐的并購(gòu)邏輯其實(shí)很簡(jiǎn)單，就是看順豐的市場(chǎng)戰(zhàn)略方向在哪里。像冷鏈、快運(yùn)、航空快遞都是順豐的市場(chǎng)戰(zhàn)略，因?yàn)轫権S的并購(gòu)也在這幾個(gè)方向上。如果再剖析一下，我認(rèn)為有2個(gè)點(diǎn)很關(guān)鍵。

看著家里的氣氛越來(lái)越緊張，兒子兒媳婦也很著急，可工作太忙沒(méi)辦法分擔(dān)，就想著早點(diǎn)給寶寶送去幼兒園，這樣也能讓我和老伴緩緩。我知道后第一個(gè)舉手贊同，可老伴不干，心疼小孫子太小，到幼兒園挨欺負(fù)。兒子兒媳婦說(shuō)沒(méi)關(guān)系，我也說(shuō)得鍛煉鍛煉，可無(wú)論我們?cè)趺磩?，老伴也不讓送，她一點(diǎn)也不考慮自己，更沒(méi)有考慮我的感受。

1.2 文庫(kù)的構(gòu)建

（四）歷史悠久的巴渝文化。西沱鎮(zhèn)是一個(gè)歷史悠久的文化古鎮(zhèn)，形成了長(zhǎng)江上游獨(dú)特的巴文化，分布著商周時(shí)期的觀音寺遺址、沙灣遺址等，有土家族風(fēng)格的吊腳樓群與漢族傳統(tǒng)風(fēng)格的古建筑群組成的云梯街。2003年11月被評(píng)為首批“中國(guó)歷史文化名鎮(zhèn)”，2008年被評(píng)選為“巴渝新十二景”之一。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制與分析

總之，采用“產(chǎn)-教-學(xué)”深度融合的教學(xué)模式，充分調(diào)動(dòng)起企業(yè)、教師、學(xué)生參與積極性，讓學(xué)生在校期間即可實(shí)現(xiàn)“學(xué)生-準(zhǔn)職業(yè)人-職業(yè)人”的身份轉(zhuǎn)變，解決學(xué)生就業(yè)與企業(yè)的銜接問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)多方共贏的人才培養(yǎng)模式與校企合作培養(yǎng)模式。

1.4 DEGs 的篩選

對(duì)ORF 同Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果，基因注釋到Uniprot、NR、NT 的 基 因 數(shù) 進(jìn) 行 統(tǒng) 計(jì)。ORF 同Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)共比對(duì)到比對(duì)18217 條結(jié)果，基因從NR 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)到32512 條基因，基因從NT 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)25821 條基因，從Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)到25084 條基因。各數(shù)據(jù)庫(kù)共同注釋基因數(shù)為10945 條。

1.5 DEGs 表達(dá)模式的聚類分析

將差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本映射到KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)（www.genome.jp/KEGG/） 進(jìn) 行KEGG pathway 分 析， 該分析與數(shù)據(jù)進(jìn)行GO 分析的方法相同。在KEGG 通路的分析中，使用經(jīng)過(guò)FDR 校準(zhǔn)后的Q 值作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，Q ≤0.05 的通路被認(rèn)定為顯著富集通路。

1.6 GO 和KEGG pathway 功能富集分析DEGs 表達(dá)模式的聚類分析

6 個(gè)的皮膚cDNA 文庫(kù)測(cè)序共獲得273945858 個(gè)raw reads。篩選獲得266625548 個(gè)clean reads，占所有樣品序列總數(shù)的98%以上。

轉(zhuǎn)錄本使用軟件Trinity 進(jìn)行組裝得到同源的和（或）可變剪接形式的轉(zhuǎn)錄本。基于過(guò)濾后的Clean Data，用Trinity 組裝出全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列，并基于轉(zhuǎn)錄本序列，取每個(gè)基因中最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本序列作為Unigene。利用Bowtie2（2.2.3 版）將用于組裝的序列與組裝后的轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行比對(duì)，使其定位到組裝轉(zhuǎn)錄本，然后統(tǒng)計(jì)比對(duì)上序列的Reads 比例。采用序列比對(duì)的方法對(duì)Trinity 組裝得到的全部轉(zhuǎn)錄本和Unigene 分別進(jìn)行BUSCO 評(píng)估，核心蛋白比對(duì)率評(píng)估，準(zhǔn)確性評(píng)估，注釋比例評(píng)估，Reads 利用率評(píng)估，利TransDecoder軟件進(jìn)行開(kāi)放閱讀框預(yù)測(cè)，然后基于Trinity 組裝的Unigene 序列和TransDecoder 預(yù)測(cè)得到的ORF 序列，通過(guò)Blast、HmmScan、SignalP、TmHMMP 等工具得到組裝結(jié)果在相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋信息，然后采用Trinotate（Trinotate Release v3.0.2）整合得到綜合的功能注釋結(jié)果。

將總RNA 隨機(jī)切割成短片段，以片段RNA 為模板合成具有隨機(jī)六聚體的第一鏈cDNA，然后加入緩沖dNTPs（dUTP 而 不 是dTTP），RnaseH， 用DNA 聚合酶Ⅰ合成第二鏈cDNA，用QiaQuick PCR 試劑盒純化，用EB 緩沖液洗脫。末端修復(fù)，堿基A 加上測(cè)序連接物，然后通過(guò)UNG（Uracil-N-Glycosylase，尿嘧啶-N-糖基化酶）鏈降解，連接產(chǎn)物通過(guò)PCR 擴(kuò)增進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物富集生成cDNA 文庫(kù)，并使用Gene Denovo Biotechnology Co.的Illumina HiSeqTM 4000 進(jìn)行測(cè)序。（中國(guó)廣州）

根據(jù)差異表達(dá)基因在每個(gè)樣品里的表達(dá)量，取以2 為底的對(duì)數(shù)后，計(jì)算歐氏距離，利用R 軟件（3.1.1版），對(duì)不同樣本的差異表達(dá)基因進(jìn)行分層聚類分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)匯總

使 用R package clusterProfiler 進(jìn) 行GO terms 和KEGG pathways 富集分析。將差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本富集到GO 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http://www.geneontology.org/）， 并計(jì)算每個(gè)術(shù)語(yǔ)的富集數(shù)，以獲得具有特定GO term 的轉(zhuǎn)錄本列表和富集數(shù)。

2.2 注釋結(jié)果

使用RPKM 估計(jì)基因表達(dá)值，使用DESeq2 對(duì)對(duì)照組和處理組之間的mRNA 進(jìn)行差異表達(dá)分析。以q值和log2差異倍數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本的篩選，閾值為|log2Ratio|≥1 和q＜0.05。

2.3 DEGs 基因的鑒定和分析

通過(guò)對(duì)DEGs 分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與處理組之間有1695 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因737 條，下調(diào)基因958 條。各小組差異基因聚類效果較好，可用于下一步的數(shù)據(jù)分析。

2.4 GO and KEGG pathway 分析

對(duì)DGEs 進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，以進(jìn)一步確認(rèn)它們參與生物過(guò)程調(diào)控的功能。GO 分析結(jié)果顯示c-vs-n 差異基因富集結(jié)果中，得到4377 個(gè)GO 分類。contractile fiber part、myosin filament、Z disc是細(xì)胞組分Ontology 最顯著富集的三個(gè)通路。muscle contraction、muscle system process、striated muscle contraction 是生物過(guò)程Ontology 最顯著富集的三個(gè)通路。structural constituent of muscle 是分子功能Ontology 富集顯著程度最高的GO 條目。

KEGG 通路分析顯示，顯著富集的前4 條KEGG 通路分別是Antigen processing and presentation、Estrogen signaling pathway、IL-17 signaling pathway和MAPK signaling pathway，在這四條通路中Hsp70和Hsp90 均顯著上調(diào)。

與干預(yù)前比較，住院規(guī)培醫(yī)師采用薩提亞心理治療模式干預(yù)后SES總分升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.34，P＜0.05）；干預(yù)前后人際關(guān)系困擾得分比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.41，P＜0.05）（見(jiàn)表1）。

3 討論

隨著農(nóng)藥使用量的逐年增加，農(nóng)藥污染日益嚴(yán)重。生物化合物多殺菌素常用于農(nóng)業(yè)和有機(jī)農(nóng)業(yè)中以對(duì)抗害蟲(chóng)[3]。全球兩棲類動(dòng)物種群衰退現(xiàn)象十分嚴(yán)重，黑斑側(cè)褶蛙是壽光地區(qū)常見(jiàn)的兩棲動(dòng)物，有研究證明這些年來(lái)，黑斑蛙的數(shù)量急劇減少[4]。

對(duì)照組和處理組差異基因顯著富集到muscle contraction、structural constituent of muscle 等條目中。而顯著富集的KEGG 通路則有四個(gè)，其中基因Hsp70、Hsp90 和IL-17 均上調(diào)。Hsp70、Hsp90 是一種熱休克蛋白，在應(yīng)激條件下表達(dá)明顯增加[5]。IL-17 是T 細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因子，與受體結(jié)合，通過(guò)MAP 激酶途徑和核轉(zhuǎn)錄因子kB（nuclearfactor kB，NF-kB）途徑發(fā)揮生物學(xué)作用[6]。我們預(yù)測(cè)多殺菌素的處理引起黑斑側(cè)褶皮膚細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫相關(guān)因子表達(dá)水平的提高，從而提高了黑斑側(cè)褶蛙皮膚對(duì)外界農(nóng)藥刺激的免疫反應(yīng)。