臺州地區(qū)非結(jié)核分枝桿菌流行趨勢研究

丁仙紅 王冬蓮 陳佳喜

[摘要] 目的 了解臺州地區(qū)臨床流行的非結(jié)核分枝桿菌的種類和感染趨勢，為臨床診療NTM肺病提供依據(jù)。 方法 回顧性分析2015～2018年來源于臺州市不同地區(qū)就診和送檢于恩澤醫(yī)療中心（集團）的1156株臨床分離分枝桿菌菌株，采用基因芯片進行菌種鑒定。 結(jié)果 1156例分枝桿菌分離出非結(jié)核分枝桿菌228例，其中胞內(nèi)分枝桿菌125例，淺黃分枝桿菌45例，鳥分枝桿菌20例，龜/膿腫分枝桿菌11例，草分枝桿菌16例，不產(chǎn)色分枝桿菌4例，金色分枝桿菌2例，堪薩斯分枝桿菌2例，瘰疬分枝桿菌1例，戈登分枝桿菌1例，海/潰瘍分枝桿菌1例。男141例，占61.84%，女87例，占38.16%。 結(jié)論 臺州地區(qū)非結(jié)核分枝桿菌感染有逐年上升的趨勢，主要以胞內(nèi)分枝桿菌為主，分離人群以男性居多。

[關鍵詞] 結(jié)核;非結(jié)核分枝桿菌;基因芯片;菌種鑒定

[中圖分類號] R521 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）26-0132-04

[Abstract] Objective To understand the types and infection trends of non-tuberculous Mycobacteria clinically prevalent in Taizhou， and to provide evidence for clinical diagnosis and treatment of NTM pulmonary disease. Methods A total of 1156 clinically isolated Mycobacterium strains admitted from different regions of Taizhou City and sent for inspection to Enze Medical Center （Group） from 2015 to 2018 were retrospective analyzed. Gene chip was used for strain identification. Results 228 cases of non-tuberculous Mycobacteria were isolated from 1156 cases of Mycobacteria， including 125 cases of intracellular Mycobacteria， 45 cases of Mycobacterium luteus， 20 cases of Mycobacterium avian， 11 cases of Mycobacterium tortoise/abscess， 16 cases of Mycobacterium tuberculosis， 4 cases of Mycobacterium chromogenes， 2 cases of Mycobacterium aureus， 2 cases of Mycobacterium kansas， 1 case of Mycobacterium dysentery， 1 case of Mycobacterium gordon and 1 case of Mycobacterium ulcerans. 141 men accounted for 61.84% and 87 women accounted for 38.16%. Conclusion Non-tuberculous mycobacterial infections have been increasing year by year in Taizhou， and the majority are intracellular mycobacteria. The segregated population is mostly male.

[Key words] Tuberculosis; Non-tuberculous mycobacterium; Gene chip; Strain identification

近年來由非結(jié)核分枝桿菌（Non-tuberculous mycobacleria，NTM）引起的肺部疾病在全球范圍內(nèi)呈增多趨勢[1]，已成為全球性公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)的疾病[2]。非結(jié)核分枝桿菌病是指除人型、牛型結(jié)核桿菌及麻風分枝桿菌以外由NTM引起的疾病，主要引起肺部的變化，與肺結(jié)核病的臨床癥狀和病理變化極為相似，NTM分離鑒定有一定難度，臨床往往誤診為結(jié)核病，且NTM對多種抗結(jié)核藥物耐藥[3]，故NTM感染性疾病診治成為臨床難點之一[4-8]。文獻相繼報道了不同地區(qū)非結(jié)核桿菌感染的分布情況，而臺州地區(qū)無相關報道。恩澤醫(yī)院屬臺州地區(qū)結(jié)核病診治的定點醫(yī)院，其他各縣區(qū)定點醫(yī)院培養(yǎng)陽性標本送檢該單位進行鑒定和藥敏實驗。本次研究對臺州地區(qū)2015～2018年就診和送檢于恩澤醫(yī)院的1156株臨床分離分枝桿菌菌株進行菌種鑒定，為臺州地區(qū)NTM的流行趨勢及菌種分布情況提供詳細研究數(shù)據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標本來源 ?收集臺州地區(qū)2015年8月～2018年12月就診和送檢于恩澤醫(yī)療中心（集團）恩澤醫(yī)院分枝桿菌陽性患者的標本。

1.1.2 儀器和試劑 ?儀器：梯度PCR儀型號T100 THERMAL CYCLER，芯片雜交儀型號BioMixer Ⅱ，芯片洗干儀型號SlideWasher 8，微陣列芯片掃描儀（結(jié)核）型號LuxScan-10K/B為北京博奧提供。試劑：分枝桿菌鑒定基因芯片試劑盒購自博奧生物集團有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 ?向標本（如痰液）中加入等體積10%NaOH溶液，渦旋振蕩，根據(jù)液化情況考慮延長液化時間或增加0.5～1.0 mL 10% NaOH溶液。

1.2.2 核酸提取 ?①將核酸提取管10 000 rpm離心1 min備用;②將液化后的樣品取1 mL上清到1.5 mL離心管中，12 000 rpm離心5 min，棄上清;③向離心管中加入1 mL生理鹽水，同一份樣品用1 mL生理鹽水轉(zhuǎn)移至一個離心管中，旋渦振蕩混勻，12 000 rpm 離心5 min，棄上清;④向每個離心管中加入50 μL核酸提取液，用移液器吹吸沉淀，將液體和沉淀一起轉(zhuǎn)移到核酸提取管中;⑤將核酸提取管置于振蕩器上，最大轉(zhuǎn)速振蕩5 min;⑥將核酸提取管置于95℃金屬浴中，加熱5 min;⑦10 000 rpm離心1 min，備用。⑧從4℃冰箱取出PCR擴增試劑，向每管加入2 μL模板DNA。每份PCR反應體系總體積為20 μL。

1.2.3 核酸擴增 ?先將反應管放入PCR儀中進行PCR擴增反應。擴增結(jié)束前半小時左右，取出雜交反應液放入雜交儀溫浴使其完全融化;擴增結(jié)束后，直接95℃變性5 min，變性結(jié)束后立即放入冰盒中至少3 min，準備雜交反應。

1.2.4 雜交反應 ?經(jīng)蓋片的加樣孔加入13.5 μL雜交反應混合物，迅速蓋上雜交盒并密封。立即將密封好的雜交盒水平放入 50℃預熱的雜交儀中，雜交2 h，轉(zhuǎn)速為5 rpm。

1.2.5 芯片洗滌 ?雜交結(jié)束前10 min，打開芯片洗干儀，將芯片放入洗干儀中，開始洗干芯片。

1.2.6 掃描判讀 ?洗滌干燥好的芯片插入掃描儀進行結(jié)果判讀。

1.3 觀察指標

對所有收集的標本進行NTM檢測，根據(jù)鑒定結(jié)果對NTM菌種每年的分布情況進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 NTM檢測

共檢測2015年8月～2018年12月收集的標本3132例，其中分枝桿菌陽性1156例，鑒定出非結(jié)核分枝桿菌228例，分離率為19.72%，2015～2018年每年的NTM檢出率見表1。其中男141例，占61.84%，女87例，占38.16%，NTM的主要分離人群以男性為主。

2.2 NTM菌種的分布情況

此次鑒定出的228例非結(jié)核分枝桿菌中，其中以胞內(nèi)分枝桿菌為主占54.82%，其余各種NTM分離率及每年的分離情況見表2。

3 討論

目前分枝桿菌感染已經(jīng)嚴重影響公共衛(wèi)生健康，成為社會關注的重要問題[9-10]。分枝桿菌分為結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌和麻風分枝桿菌等。非結(jié)核分枝桿菌廣泛存在于自然界中，在動物、土壤、水中都有發(fā)現(xiàn)[11]，不發(fā)生人與人之間的傳播，但感染后能引起人體的廣泛疾病，它可導致皮膚和軟組織感染、淋巴結(jié)炎、慢性肺病及全身播散型NTM病[12]。

NTM病在亞洲地區(qū)和歐美國家發(fā)病率逐年上升[13]，在我國從5次的流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，NTM的檢出率已從原來的4.2%增加到22.9%[14]。在韓國2015年NTM的感染率比2009年增加了一倍[15-16]。日本報道每年10萬人中有14.7例感染[17]。臺灣從2010～2014年每10萬患者感染46.0例[18]。NTM的感染率和菌種分布不同地域、不同氣候環(huán)境存在差異，呈現(xiàn)出南方高于北方，沿海高于內(nèi)地，氣候溫和地區(qū)高于寒冷地區(qū)的流行特點[19]。臺州位于中國東南沿海，氣候溫暖潮濕，是NTM的高發(fā)區(qū)。本研究檢測了2015年8月～2018年12月臺州市不同地區(qū)就診和送檢于臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）恩澤醫(yī)院的1156例臨床分離分枝桿菌菌株，通過基因芯片鑒定的方法，最終鑒定228例為非結(jié)核分枝桿菌，NIM總感染率或分離率為19.72%，明顯高于內(nèi)地湖南省的10.17%[20]、衢州市的4.78%[21]，接近全國20%～25%的感染率或分離率[22-24]，且逐年呈現(xiàn)上升的趨勢。分離種類較多，其中排名前5的分別是胞內(nèi)分枝桿菌（54.8%）、淺黃分枝桿菌（19.8%）、鳥分枝桿菌（8.8%）、草分枝桿菌（7.%）、龜/膿腫分支桿菌（4.8%），表明臺州地區(qū)主要以胞內(nèi)分枝桿菌感染為主，與溫州、南京地區(qū)報道一致[25-26]。在我國海南、廣州、上海以龜/膿腫分枝桿菌為主，北京以鳥/胞分枝桿菌復合群和堪薩斯分枝桿菌為主，山東和福建以鳥/胞分枝桿菌復合群為主，因此菌種應地理環(huán)境的不同相差較大。NTM分離人群男性明顯高于女性，與余斐等[27]的研究一致，與海南報道女性多于男性有一定的差異。

NTM的感染主要與人體免疫力相關，隨著人們壽命延長，老年人口增多，老年人由于免疫器官衰退，免疫力低下是NTM的易感人群。近年來艾滋病患者人數(shù)越來越多，其感染HIV病毒后，人體CD4+T淋巴細胞嚴重破壞，使淋巴細胞數(shù)量進行性下降，更容易發(fā)生NTM的感染。且不同的NTM對治療藥物的敏感性存在差異，感染的宿主也存在差異。因此，如何快速準確鑒定到種對臨床提早明確診斷和NTM流行病學研究非常重要。傳統(tǒng)的分枝桿菌鑒定主要是PNB、TCH改良的羅氏培養(yǎng)法，操作繁瑣，分枝桿菌的生長速度較慢，培養(yǎng)時間長，干擾因素多，無法精準的鑒定到種，極易對臨床的診治造成延誤和產(chǎn)生耐藥。本實驗主要采用基因芯片技術，操作簡便，鑒定時間短，結(jié)果更加準確，為臨床及時診斷疾病和針對性用藥提供參考。

本研究還存在一定的局限，首先，這是一項回顧性分析，僅收集了一家醫(yī)院的數(shù)據(jù)，未對臺州地區(qū)其他醫(yī)院所有分枝桿菌陽性標本進行鑒定。其次，本研究采用基因芯片的方法，由于方法學限定鑒定的菌種有限，存在漏檢的可能。再次，本研究只對非結(jié)核分枝桿菌的菌種分布作了分析，未對其耐藥情況進行研究，今后針對以上問題還需做進一步的研究。

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