甲狀腺乳頭狀癌組織中p-Akt及VEGF-C的表達及臨床意義

郭靈敏 馮偉兆 李林株

[摘要] 目的 探討甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma）組織磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-C（VEGF-C）表達水平，及其與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 方法 選取我院2012年1月～2018年12月的甲狀腺乳頭狀癌病理標(biāo)本70例（研究組），另選取正常甲狀腺組織31例（對照組），應(yīng)用免疫組化SP法測定p-Akt、VEGF-C、D2-40在兩組中的表達情況，并分析其與臨床病理的關(guān)系。 結(jié)果 甲狀腺乳頭狀癌組織中p-Akt、VEGF-C、D2-40（MLVD）的陽性表達率分別為60.0%、66.0%、（10.37±2.61），均顯著高于正常甲狀腺組織的9.7%、6%、（3.08±0.93）（P<0.01）。p-Akt、VEGF-C在甲狀腺乳頭狀癌組織的表達和臨床分期、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及MLVD有關(guān)，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與腫瘤大小、年齡及性別無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。甲狀腺乳頭狀癌組織中p-Akt、VEGF-C蛋白表達水平呈正相關(guān)（r=0.455，P<0.05），有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的MLVD顯著高于無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 甲狀腺乳頭狀癌組織中p-Akt、VEGF-C呈過表達狀態(tài)，共同參與淋巴結(jié)的侵襲與轉(zhuǎn)移，兩個通路可能存在相關(guān)性，阻斷PI3K/Akt通路有望為甲狀腺乳頭狀癌的靶向治療提供一種新的思路。

[關(guān)鍵詞] 甲狀腺乳頭狀癌;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-C;磷酸化蛋白激酶B;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

[中圖分類號] R736.1 ? ? ? ? ?[文獻標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）26-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the expression levels of phosphorylated protein kinase B（P-PKB， also p-Akt） and vascular endothelial growth factor-C（VEGF-C） in papillary thyroid carcinoma tissues， and their relationships with clinicopathological features of papillary thyroid carcinoma and cervical lymph node metastasis. Methods 70 pathological specimens of papillary thyroid carcinoma in our hospital from January 2012 to December 2018 were selected as the study group and another 31 cases of normal thyroid tissues were selected as the control group. The expressions of p-Akt， VEGF-C and D2-40 in the two groups were tested by immunohistochemical SP method， and the relationships with clinical pathology were analyzed. Results The positive expression rates of p-Akt， VEGF-C and D2-40（MLVD） in papillary thyroid carcinoma tissues were 60.0%， 66.0% and（10.37±2.61）， respectively， which were significantly higher than 9.7%， 6.0% and（3.08±0.93） in normal thyroid tissues（P<0.01）. The expressions of p-Akt and VEGF-C in papillary thyroid carcinoma tissues were related to clinical stage， cervical lymph node metastasis and MLVD， with statistically significant differences（P<0.05）， but not related to tumor size， age and gender， and the differences were statistically insignificant（P>0.05）. The protein expression levels of p-Akt and VEGF-C in papillary thyroid carcinoma tissues were positively correlated（r=0.455， P<0.05）. The MLVD of the patients with cervical lymph node metastasis was significantly higher than that of the patients without cervical lymph node metastasis， and the difference was statistically significant（P<0.01）. Conclusion P-Akt and VEGF-C were over-expressed in papillary thyroid carcinoma tissues， and they were jointly involved in the invasion and metastasis of lymph nodes. There may be correlation between the two pathways， and blocking PI3K/Akt pathway is expected to provide a new idea for targeted treatment of papillary thyroid carcinoma.

[Key words] Papillary thyroid carcinoma; Vascular endothelial growth factor-C; Phosphorylated protein kinase B; Lymph node metastasis

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌中最多見的組織類型[1]，盡管生物學(xué)行為良好，惡性程度不高，但由于周圍區(qū)域富含淋巴結(jié)，早期便可淋巴轉(zhuǎn)移而影響長期生存，提示臨床可以增大手術(shù)清掃范圍，但由于缺少客觀指標(biāo)的支持，手術(shù)醫(yī)生對是否可淋巴結(jié)清掃一直是持有爭論的，故與甲狀腺乳頭狀癌起病、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)的因素成為近些年研究的焦點。PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路在腫瘤細(xì)胞生長、侵襲等步驟起著重要作用[2]，而磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt）作為一種胞質(zhì)信號傳導(dǎo)蛋白，在通路中扮演關(guān)鍵的效應(yīng)因子。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）是第一個被研究的淋巴管生成促進因子，關(guān)系到甲狀腺乳頭狀癌的淋巴轉(zhuǎn)移[3]。研究腫瘤組織分泌淋巴管生長因子的始發(fā)因素報道不多，且p-Akt與VEGF-C兩者的關(guān)系對侵襲、淋巴轉(zhuǎn)移的影響在PTC更是甚少，因而本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測PTC組織中p-Akt與VEGF-C蛋白的表達，旨在分析二者在PTC進展中的變化規(guī)律及意義，同時檢測微淋巴管密度（micro lymphatic vessel density，MLVD），討論與淋巴轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2012年1月～2018年12月70例根治術(shù)切除PTC標(biāo)本作為研究組?；颊吣挲g20～74歲，中位年齡42歲;男20例，女50例;頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無轉(zhuǎn)移45例;臨床病理分期Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ～Ⅳ期22例。另選取31例因甲狀腺良性疾病行手術(shù)切除患者的正常甲狀腺（normal thyroid，NT）組織作對照組，患者年齡18～77歲，中位年齡38歲;男7例，女24例。兩組一般情況比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，病患均簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：據(jù)2017年修訂的第二版《NCCN甲狀腺腫瘤指南》[4]為參考，術(shù)前經(jīng)細(xì)針穿刺或術(shù)中冰凍診斷為PTC，且經(jīng)根治術(shù)后病理診斷一致。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前放療或化療;②僅細(xì)針穿刺細(xì)胞診斷無術(shù)后診斷;③未行根治手術(shù)的標(biāo)本;④病歷不完整者。

1.3 方法

所有手術(shù)標(biāo)本均通過10%甲醛固定、脫水包埋、4 μm厚度連續(xù)切片后進行免疫組化SP三步法染色，著色流程按商品規(guī)范進行，常規(guī)脫蠟水化，EDTA緩沖液（pH 9.0）95℃下進行抗原熱修復(fù)，3%過氧化氫阻斷劑阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，加抗體，經(jīng)DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。p-Akt兔抗人多克隆抗體購于美國Cell Signaling公司，VEGF-C兔抗人多克隆抗體、D2-40鼠抗人單克隆抗體、S-P法試劑盒均來源福州邁新生物公司，DAB顯色劑購于丹麥Dako公司，采用試劑包提供的陽性組織作為陽性對照，以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照。

1.4 觀察指標(biāo)

p-Akt及VEGF-C以胞漿呈黃色為陽性。在病變典型區(qū)域連續(xù)閱覽10個高倍視野（×400）計1000個腫瘤細(xì)胞，并計算腫瘤細(xì)胞的平均陽性率，采用雙評分半定量計分法[5]判斷著色結(jié)果：以多數(shù)細(xì)胞的著色情況為指標(biāo)評分，無色為0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分;陽性率≤5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，≥51%記3分。兩評分乘積≥3分為陽性。D2-40為胞漿和（或）胞膜呈黃色為陽，MLVD計算依據(jù)Choi等[6]方法，選取5個脈管高密度的視野，用高倍（×200）計算每個視野中的微淋巴管目，取均值。微淋巴管的判定標(biāo)準(zhǔn)：任何被染成黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或簇，或條索狀管狀的細(xì)胞團，均作為一個微淋巴管。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組獨立樣本計量資料比較采用t檢驗，計量資料相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)，計數(shù)資料相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-Akt、VEGF-C和D2-40在PTC及正常甲狀腺組織中表達特點及差異

研究組p-Akt、VEGF-C胞漿著色，特別是在腫瘤的外圍區(qū)域及壞死周邊細(xì)胞表達多，對照組多陰性，且僅為散在弱陽著色。PTC組織中p-Akt和VEGF-C的陽性表達率分別為60.0%和66.0%，顯著高于正常組織的9.7%和6.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.01）（表1）。D2-40多表達在腫瘤周圍的脈管，在腫瘤中央的脈管較少表達，可能是受腫瘤的物理擠壓等緣由[7]，PTC的MLVD為（10.37±2.61）明顯高于正常甲狀腺的（3.08±0.93），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=15.097，P<0.01）。

2.2 p-Akt、VEGF-C與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理因素的關(guān)系

p-Akt、VEGF-C陽性表達與患者的TNM分期及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而與性別、年齡、腫瘤大小無相關(guān)性（P>0.05）（表2）。

2.3 甲狀腺乳頭狀癌中p-Akt、VEGF-C與MLVD的相關(guān)性

42例p-Akt陽性表達的甲狀腺乳頭狀癌組織MLVD為（11.79±3.11），28例p-Akt陰性表達的MLVD為（7.01±1.81），p-Akt陽性表達與MLVD呈正相關(guān)（r=0.523，P<0.05）。46例VEGF-C陽性表達的甲狀腺乳頭狀癌組織MLVD為（12.58±3.17），24例VEGF-C陰性表達的MLVD為（6.97±1.75），VEGF-C陽性表達與MLVD呈正相關(guān)（r=0.556，P<0.01）。

2.4 甲狀腺乳頭狀癌中p-Akt、VEGF-C的相關(guān)性

經(jīng)Spearman相關(guān)分析，p-Akt、VEGF-C蛋白表達水平呈正相關(guān)（r=0.455，P<0.05），見表3。

2.5 甲狀腺乳頭狀癌中MLVD與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

25例有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的MLVD為（16.56±3.93），45例無頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的MLVD為（7.11±1.69），兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.022，P<0.01）。

3 討論

甲狀腺癌的發(fā)病率相對來說較高，且每年的發(fā)生率都在增長，作為研究一種主要涉及多個癌基因且抑癌基因失活的病變，遺傳信息的突變與缺失、通路中各信號蛋白的異常可以表達在甲狀腺癌的起始、進展及侵犯能力轉(zhuǎn)移過程中扮演著非常重要的作用，盡管在國內(nèi)甲狀腺乳頭狀癌患者5年的生存率有90%以上，但因為較高的局部和遠處轉(zhuǎn)移率，腫瘤治療后復(fù)發(fā)可能是影響預(yù)后產(chǎn)生不良的首要原因。

PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路廣泛存在于人體的各類細(xì)胞中，主要是調(diào)控細(xì)胞增長的一個關(guān)鍵信號，可用于激發(fā)生存信號，從而保持人體細(xì)胞的生長。在通路中Akt作為一個重要節(jié)段而被重視，在PI3K通路中，信號激活后所產(chǎn)生的蛋白與Akt的PH區(qū)結(jié)合，被磷酸化為具有磷酸激酶活性的p-Akt，所以p-Akt數(shù)量的增多可以作為信號傳導(dǎo)處于正向作用的激活標(biāo)志，通過激活Bcl-2家族、eNOS、NF-κB、mTOR、S6蛋白激酶等下游靶蛋白，或者磷酸化凋亡調(diào)節(jié)蛋白從而阻止細(xì)胞的凋亡來反向發(fā)揮激活作用[8]，并且促進脈管生成和擴張，加速了腫瘤細(xì)胞的侵犯轉(zhuǎn)移。VEGF-C已在多個研究中明確是一種主要的淋巴管生長促進因子，在許多不同組織來源的腫瘤細(xì)胞中能分泌VEGF-C，在容易通過淋巴管發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤中發(fā)現(xiàn)VEGF-CmRNA轉(zhuǎn)錄的發(fā)生及蛋白的表達明顯是高于通過新生血管轉(zhuǎn)移的[9]。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞可表達受體VEGFR-3，VEGF-C可與VEGFR-3受體結(jié)合形成二聚反應(yīng)活化，并啟動介導(dǎo)MAPK信號傳導(dǎo)，從而促進淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增生，并增加淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜的通透性，活化細(xì)胞骨架Paxillin蛋白，從而加速脈管內(nèi)皮細(xì)胞的變形及轉(zhuǎn)移，最終影響淋巴管的形成和性狀，腫瘤細(xì)胞便通過結(jié)構(gòu)和性狀均不完整的新生微淋巴管浸潤而侵入淋巴系統(tǒng)并發(fā)生轉(zhuǎn)移，還可以依靠各種細(xì)胞因子的分泌來改變局部微環(huán)境等方式，使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移后更有可能在淋巴系統(tǒng)中生存[10]。D2-40是近些年發(fā)現(xiàn)的一種強特異性和高敏感性的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志[11]，通過D2-40染色來統(tǒng)計MLVD，在腫瘤新生微淋巴管的量化研究中是一種實用的方法，腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不可缺少的一個因素就是微淋巴管的產(chǎn)生，因此可以將MLVD來作為腫瘤刺激淋巴管生成能力的標(biāo)識。

本研究發(fā)現(xiàn)，研究組中p-Akt及VEGF-C的陽性表達率明顯高于對照組，提示p-Akt及VEGF-C主要存在腫瘤組織細(xì)胞中，可作為反映PTC的標(biāo)志物。在與臨床病理的特征中，p-Akt及VEGF-C與腫瘤大小、患者年齡和性別無關(guān)，而與腫瘤的TNM分期以及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，顯示出明顯的淋巴結(jié)侵犯性;此外腫瘤組織p-Akt及VEGF-C的表達與MLVD均呈相關(guān)性，提示p-Akt及VEGF-C的過度表達導(dǎo)致腫瘤中微淋巴管的新生;在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中MLVD明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。以上結(jié)果表明二者的過度表達臨床可以作為推測腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良評測的重要指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，甲狀腺PTC組織p-Akt、VEGF-C蛋白表達水平具有相關(guān)性，提示p-Akt可增加VEGF-C的表達。p-Akt通過Akt信號通路的激活得以產(chǎn)生，VEGF-C則通過MAPK信號通路來表達，說明兩者的通路可能具有相關(guān)，存在Akt/VEGF-C通路，p-Akt的過度表達一方面推動腫瘤細(xì)胞的增生，或抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡;再一方面促進VEGF-C的相關(guān)基因啟動子的活力來加速表達[12]，導(dǎo)致腫瘤微淋巴管新生，管腔擴大，管壁基底膜通透率增加，方便腫瘤細(xì)胞游走侵襲進入脈管而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，并向遠處擴張。其他相關(guān)研究同樣顯示，PI3K/Akt與VEGF通路是有協(xié)同作用存在關(guān)聯(lián)的[13，14]，但其具體分子機制有待更深層的研究。兩通路相互協(xié)同共同作用PTC發(fā)生早期浸潤及轉(zhuǎn)移，提示阻斷兩信號傳導(dǎo)通路對治療有利，Wortmannin（渥曼青霉素）屬經(jīng)典的PI3K/Akt信號傳導(dǎo)途徑抑制劑，其主要抑制PI3K的催化亞基p110的激酶活性來阻止下游的傳導(dǎo)，抑制瘤組織增長及脈管的形成[15]。也有研究顯示，通過內(nèi)含子MicroRNAs-27b抑制VEGF-C蛋白可降低淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[16]，而淋巴結(jié)受累則影響著患者臨床預(yù)后，伴有淋巴結(jié)受累的PTC患者術(shù)后易復(fù)發(fā)[17]。因此，筆者考慮探討任何疾病包括PTC的抗轉(zhuǎn)移機制和處理方法將是未來有針對性研究的重點，對于改善病變的后果，改善患者的預(yù)后具有重要的臨床意義。然而，由于腫瘤的產(chǎn)生內(nèi)部關(guān)系復(fù)雜，各個通路間息息相關(guān)，所以現(xiàn)在研究多只能局限于個別簡單的靶點治療。因此，若在這兩個通路傳導(dǎo)途徑抑制劑能組合使用，則能更高效地阻礙腫瘤的快速生長，當(dāng)然也爭取尋求更有效的、強的腫瘤特異性靶向藥物療法。

總之，在甲狀腺PTC患者的標(biāo)本中VEGF-C、p-Akt這兩個蛋白表現(xiàn)出超常的表達能力，早期過程便在淋巴管轉(zhuǎn)移起重要影響，作為新的治療手段和方法，針對性的阻斷這兩個蛋白產(chǎn)生的過程是可行的，同時聯(lián)合其他檢測手段比如觸診、B超等能更準(zhǔn)確地評估淋巴結(jié)是否處于病變的狀態(tài)，有利于臨床制定個性化的手術(shù)方案。

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（收稿日期：2020-05-25）