干燥綜合征基因差異譜的生物信息學(xué)分析

蔡鑫 唐芳 馬武開 蘭維婭 蔣總 樊梅 金澤旭

【摘 要】目的：應(yīng)用生物信息學(xué)方法研究干燥綜合征的差異基因，為干燥綜合征的治療提供新靶點(diǎn)。方法：在GEO數(shù)據(jù)庫中下載并篩選干燥綜合征相關(guān)的差異表達(dá)基因，利用STRING在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白與蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用Cytoscape軟件篩選出關(guān)鍵基因，通過DAVID數(shù)據(jù)平臺對差異基因進(jìn)行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。結(jié)果：通過分析基因芯片GSE127952后獲得406個差異基因，篩選出STAT1、MX1、IFIT1、IFIT3、ISG15等10個關(guān)鍵基因;GO分析顯示差異基因主要富集在正向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生、淋巴細(xì)胞分化、T細(xì)胞活化等生物學(xué)過程;KEGG分析主要涉及細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等。結(jié)論：上述所得的關(guān)鍵基因和信號通路可能與干燥綜合征的疾病過程相關(guān)，為深入研究靶向治療干燥綜合征提供了理論參考。

【關(guān)鍵詞】 干燥綜合征;差異基因;生物信息學(xué);分子機(jī)制

【ABSTRACT】Objective：To study the differential genes of Sj?gren's syndrome by bioinformatics，and to provide a new target for the treatment of Sj?gren's syndrome.Methods：The deferentially expressed genes related to Sj?gren's syndrome were downloaded and screened from the GEO database.The protein-protein interaction network was constructed by STRING online database.The key genes were screened out using the software of Cytoscape.The enrichment analyses of GO and KEGG for differential genes were carried out using DAVID data platform.Results：Four hundred and six deferentially expressed genes were obtained by analyzing gene chip GSE127952，and 10 key genes?including STAT1，MX1，IFIT1，IFIT3 and ISG15 were screened out.Go analysis showed that the differential genes were mainly concentrated in biological processes such as positively regulating cytokine production，lymphocyte differentiation and T cell activation.KEGG analysis mainly involved the interaction between cytokines and cytokine receptors，chemotactic factor signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，T cell receptor signaling pathway，etc.Conclusion：Above key genes and signal pathways may be related to the disease process of Sj?gren's syndrome，which provides a theoretical reference for further research on the targeted treatment of it.

【Keywords】 Sj?gren's syndrome;differential gene;bioinformatics;molecular mechanism

干燥綜合征（Sj?gren's syndrome，SS）是一種慢性自身免疫性疾病，病變累及的靶器官主要包括淚腺、唾液腺等外分泌腺體。SS可根據(jù)是否合并其他風(fēng)濕病分為原發(fā)性干燥綜合征（primary Sj?gren's syndrome，pSS）與繼發(fā)性干燥綜合征（secondary Sj?gren's syndrome，sSS），SS患者臨床表現(xiàn)多樣，除了具有典型的癥狀如口干、眼干等，也可出現(xiàn)多系統(tǒng)損害，如疲乏、肌肉關(guān)節(jié)疼痛、皮疹反復(fù)發(fā)作[1]。目前，本病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，亦無特效藥物治療，臨床中主要通過對癥處理和替代療法緩解癥狀、改善病情[2]。生物信息學(xué)屬于生命科學(xué)范疇的一門新興學(xué)科，近年來為理解疾病發(fā)生的分子機(jī)制和開展基礎(chǔ)研究帶來了可供選擇的思路及可能的理論依據(jù)[3]。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法，對GEO數(shù)據(jù)庫中pSS患者與健康志愿者小唾液腺組織的基因芯片進(jìn)行分析，篩選獲得與疾病相關(guān)的差異表達(dá)基因，對差異基因進(jìn)行富集分析，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（PPI）關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，識別pSS發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步研究其發(fā)病機(jī)制提供生物信息學(xué)理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料 借助NCBI中Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫收集pSS相關(guān)的基因表達(dá)譜芯片，獲得的芯片編號為GSE127952。該芯片基因數(shù)據(jù)包括8例pSS患者和6例健康志愿者的小唾液腺組織。

1.2 篩選pSS差異表達(dá)基因 在GEO數(shù)據(jù)庫中下載基因芯片編號為GSE127952的原始數(shù)據(jù)文件和編號為GPL20995-16144的芯片注釋文件。借助R軟件篩選出差異表達(dá)基因并繪制火山圖，篩選條件為P < 0.05、|log2FC|≥1.5（其中|log2FC|≥1.5為上調(diào)基因，|log2FC| < 1.5為下調(diào)基因）。

1.3 PPI分析 將篩選出的差異基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（得分 > 0.4分），然后下載TSV格式的PPI數(shù)據(jù)包，運(yùn)用Cytoscape軟件對中心度值（Degree）≥10的基因進(jìn)行可視化分析，利用插件CytoHubba分析獲得前10個關(guān)鍵差異基因[4]。

1.4 差異表達(dá)基因的富集分析 借助DAVID分析平臺對差異基因做基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，利用R軟件對富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 差異基因的篩選 利用R軟件分析pSS患者和健康人小唾液腺組織基因譜芯片，得到差異表達(dá)基因406個，包括上調(diào)基因226個和下調(diào)基因180個。繪制差異表達(dá)基因火山圖，見圖1。

2.2 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)和篩選關(guān)鍵差異基因 利用STRING數(shù)據(jù)庫對406個差異基因構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將Degreee≥10的基因?qū)隒ytoscape軟件進(jìn)行可視化分析，該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)包含99個節(jié)點(diǎn)、1101條邊，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)大小由Degree值決定，節(jié)點(diǎn)間相互連線（邊）粗細(xì)代表連邊緊密度，中心度以冷色至暖色表示，見圖2。使用Cytoscape的插件CytoHubba篩選獲得關(guān)鍵的差異基因，包括STAT1、MX1、IFIT1、IFIT3、ISG15、GBP1、IFIT2、RSAD2、IFI44L、DDX60，見圖3。

2.3 差異基因的GO和KEGG富集分析 為研究差異表達(dá)基因在pSS中的作用機(jī)制，將上述獲得的差異基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG富集分析[5]。GO主要涉及對病毒反應(yīng)、正向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生、淋巴細(xì)胞分化等生物學(xué)過程，參與質(zhì)膜外側(cè)、收縮纖維、肌節(jié)等細(xì)胞組分（CC），參與趨化因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、肌動蛋白結(jié)合等分子功能（MF），見圖4。KEGG主要富集在細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路、Toll樣受體（TLRs）信號通路等信號通路，見圖5。

3 討 論

SS是一種自身免疫性系統(tǒng)性疾病，而非口干、眼干的單一性疾病。目前，治療SS的隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)研究結(jié)果不盡相同，用藥尚缺少高級別循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支撐，臨床中更多為經(jīng)驗(yàn)性用藥[6]。因此，從多靶點(diǎn)和多通路的研究角度出發(fā)，深入對SS發(fā)病機(jī)制的探索以發(fā)現(xiàn)潛在的治療新靶點(diǎn)，具有重要意義。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法，通過對pSS患者和健康人小唾液腺組織的基因芯片進(jìn)行挖掘，共得到406個差異表達(dá)基因，對這些差異基因進(jìn)行PPI分析并篩選出關(guān)鍵基因，最后進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以期為深入研究SS發(fā)病機(jī)制提供理論參考。

通過對差異基因PPI網(wǎng)絡(luò)的分析，獲得的關(guān)鍵基因包括STAT1、MX1、IFIT1、IFIT3、ISG15、GBP1、IFIT2、RSAD2、IFI44L、DDX60。STAT1在α/β-干擾素（IFN-α/β）、IFN-γ等細(xì)胞因子激活下被磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細(xì)胞分化、生長、凋亡，以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等生物學(xué)功能[7]。STAT1活化后可引起活性氧累積，損傷細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肺纖維化、動脈粥樣硬化及高血壓等[8]。pSS相關(guān)的間質(zhì)性肺病患者血清中活性氧明顯增多[9]，可能在肺纖維化形成過程中具有重要生物學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn)，STAT1在pSS患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)較正常人明顯升高[10]。MX1是基于IFN抗病毒反應(yīng)的主要介質(zhì)，受Ⅰ型IFN的調(diào)節(jié)，MX1基因表達(dá)與疾病活動有關(guān)，可能作為其潛在的生物標(biāo)志物，病情活躍的pSS患者具有更高水平的MX1[11]。IFIT1、IFIT2、IFIT3同屬于IFN誘導(dǎo)蛋白家族，能夠抑制病毒復(fù)制，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和天然免疫通路[12-13]。

ISG15是由IFN刺激基因編碼的蛋白，參與抗病毒免疫反應(yīng)、RNA剪接、修復(fù)染色體等多種生理過程，通過調(diào)節(jié)IFN水平或直接作用于病毒蛋白而發(fā)揮抗病毒作用[14]。GBP1主要涉及抗腫瘤和抵抗病原微生物[15]，RSAD2可作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的預(yù)測因子，是一種有著廣泛活性的抗病毒基因[16]。本研究篩選出的關(guān)鍵差異基因主要涉及抗病毒感染和調(diào)節(jié)免疫方面，SS的發(fā)病與病毒感染引起自身免疫反應(yīng)相關(guān)[17]，這些基因可能有助于進(jìn)一步理解病毒感染在SS中的作用機(jī)制，為本病的治療提供新思路。

借助DAVID分析平臺對上述差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果顯示，GO主要涉及抗病毒、正向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生、淋巴細(xì)胞分化等生物學(xué)過程，參與質(zhì)膜外側(cè)、收縮纖維、肌節(jié)等細(xì)胞組分，參與趨化因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、肌動蛋白結(jié)合等分子功能。以上涉及的生物學(xué)過程與病毒感染和免疫系統(tǒng)反應(yīng)關(guān)系密切。當(dāng)前的研究認(rèn)為，病毒感染和免疫功能紊亂參與了SS的疾病過程[18-19]。上述生物過程及分子功能與免疫系統(tǒng)功能密切相關(guān)，而免疫系統(tǒng)功能的異常導(dǎo)致了RA的發(fā)生、發(fā)展。KEGG主要富集在細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、趨化因子信號通路及TLRs信號通路等信號通路。pSS患者的免疫性炎癥反應(yīng)受細(xì)胞因子調(diào)控，這些細(xì)胞因子的異常表達(dá)可能影響疾病發(fā)生、發(fā)展，包括T細(xì)胞因子、IFN、白細(xì)胞介素（IL）、趨化因子等。IFN-γ能誘導(dǎo)SS患者唾液腺組織中細(xì)胞因子IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）異常表達(dá)，TNF-α分泌又能刺激唾液腺局部炎癥細(xì)胞浸潤，加重腺體破壞[20-21]。趨化因子與受體相互作用可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和淋巴樣細(xì)胞的聚集，使SS的外分泌腺體被淋巴細(xì)胞浸潤并形成異位生發(fā)中心，趨化因子CXCL13、CXCL9等在SS患者唾液腺組織中的表達(dá)明顯增多[22]，CXCL10或許能成為早期診斷SS的生物標(biāo)志物[23]，趨化因子與疾病進(jìn)展密切相關(guān)，進(jìn)一步探索其生物學(xué)特點(diǎn)有助于闡明SS發(fā)病機(jī)制，使用抗趨化因子的治療方法可能減少異位生發(fā)中心形成和降低淋巴細(xì)胞的浸潤程度。TLRs可表達(dá)在巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等非免疫細(xì)胞中，能夠?qū)共≡⑸镎T發(fā)的免疫應(yīng)答[24]。TLR4、TLR7、TLR9等在pSS患者中的表達(dá)明顯高于健康人[25]。TLRs可識別細(xì)胞在損傷以及修復(fù)過程中所釋放出的內(nèi)源性因子，說明其是誘導(dǎo)pSS發(fā)生的重要因素。TLRs能夠刺激IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子釋放，引起過度的炎性反應(yīng)，進(jìn)一步加重SS病情。

綜上所述，本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法深入挖掘pSS基因表達(dá)譜芯片，篩選獲得關(guān)鍵差異基因，可能作為其潛在的靶點(diǎn)蛋白;通過對差異基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析得出的結(jié)果有助于提高對pSS分子機(jī)制的理解，為今后進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究提供可能的理論參考和新思路。由于本研究樣本量有限，所得結(jié)果可能存在偏倚;今后研究應(yīng)增加樣本量，進(jìn)一步探討與SS疾病過程相關(guān)的差異基因。

參考文獻(xiàn)

[1] FISHER BA，JONSSON R，DANIELS T，et al.Standardisation of labial salivary gland histopathology in clinical trials in primary Sj?gren's syndrome[J].Ann Rheum Dis，2017，76（7）：1161-1168.

[2] D?RNER T，POSCH MG，LI Y，et al.Treatment of primary Sj?gren's syndrome with ianalumab （VAY736） targeting B cells by BAFF receptor blockade coupled with enhanced，antibody-dependent cellular cytotoxicity[J].Ann Rheum Dis，2019，78（5）：641-647.

[3] BIAN Q，CAHAN P.Computational tools for stem cell biology[J].Trends Biotechnol，2016，34（12）：993-1009.

[4] DA FONSECA-PEREIRA P，NERI-SILVA R，CAVALCANTI JHF，et al.Data-Mining Bioinformatics：Connecting Adenylate Transport and Metabolic Responses to Stress[J].Trends Plant Sci，2018，23（11）：961-974.

[5] CHEN YJ，CHANG WA，WU LY，et al.Systematic analysis of differential expression profile in rheumatoid arthritis chondrocytes using next-generation sequencing and bioinformatics approaches[J].Int J Med Sci，2018，15（11）：1129-1142.

[6] CARSONS SE，VIVINO FB，PARKE A，et al.Treatment guidelines for rheumatologic manifestations of Sj?gren's syndrome：use of biologic agents，management of fatigue，and inflammatory musculoskeletal pain[J].Arthritis Care Res，2017，69（4）：517-527.

[7] BATHIGE SDNK，UMASUTHAN N，GODAHEWA GI，et al.Molecular insights of two STAT1 variants from rock bream （Oplegnathus fasciatus）and their transcriptional regulation in response to pathogenic stress，interleukin-10，and tissue injury[J].Fish Shellfish Immunol，2017，69（2）：128-141.

[8] SHEN L，ZHOU T，WANG J，et al.Daphnetin reduces endotoxin lethality in mice and decreases LPS-induced inflammation in Raw264.7 cells via suppressing JAK/STATs activation and ROS production[J].Inflamma Rese，2017，66（7）：579-589.

[9] 白淑榮，沈樂，陳乾，等.原發(fā)性干燥綜合征相關(guān)間質(zhì)性肺疾病患者血清活性氧、轉(zhuǎn)錄因子κB及轉(zhuǎn)化生長因子β1水平變化及其臨床意義研究[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2017，25（ 11）：42-45.

[10] PERTOVAARA M，SILVENNOINEN O，ISOM?KI P.STAT-5 is activated constitutively in T cells，B cells and monocytes from patients with primary Sj?gren's syndrome[J].Clin Exp Immunol，2015，181（1）：29-38.

[11] AIR? P，GHIDINI C，ZANOTTI C，et al.Upregulation of myxovirus-resistance protein A：a possible marker of type Ⅰ interferon induction in systemic sclerosis[J].J Rheumatol，2008，35（11）：2192-2200.

[12] ZHANG J，SZE DMY，YUNG BYM，et al.Distinct expression of interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats （IFIT） 1/2/3 and other antiviral genes between subsets of dendritic cells induced by dengue virus 2 infection[J].Immunology，2016，148（4）：363-376.