腌制過程中亞硝酸鈉對羊肉脂肪酸組成以及脂質(zhì)氧化的影響

姬曉穎，馬國源，陳耀祥，金錦偉，余群力

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅中天羊業(yè)股份有限公司，甘肅 定西 743000；3.青海5369生態(tài)牧業(yè)科技有限公司，青海 果洛 814000)

肉的腌制是肉品貯藏的一種傳統(tǒng)手段，也是肉品生產(chǎn)常用的加工方法.亞硝酸鈉在肉制品加工的過程中,主要用作發(fā)色劑、防腐劑和抗氧化劑[1].肉在腌制過程中添加亞硝酸鹽會產(chǎn)生獨特?zé)岱€(wěn)定的腌制顏色，可明顯改善肉類制品的感官品質(zhì)[2].亞硝酸鹽可抑制肉毒梭狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌和產(chǎn)氣莢膜桿菌等的生長繁殖，有利于肉制品的貯藏和貨架期的延長[3-4].亞硝酸鹽可以防止肉制品酸敗，延長其保質(zhì)期[5]，因此在腌制肉制品過程中使用亞硝酸鹽已經(jīng)非常普遍.但是在腌制肉制品中如果亞硝酸鹽添加量超過國標(biāo)最大使用量150 mg/kg時，就會對人體產(chǎn)生毒副作用[6-7].隨著公眾食品安全意識的提高，人們對肉制品中添加亞硝酸鹽持消極態(tài)度，致使肉制品中添加亞硝酸鹽的量被肉品腌制研究關(guān)注與重視.

雖然世界各國的肉類研究機構(gòu)和生產(chǎn)廠家都在不斷積極研發(fā)一種經(jīng)濟(jì)適用、安全可靠、能代替亞硝酸鈉的肉品發(fā)色劑，如嘗試用麥芽酚、抗壞血酸、葡萄糖酸鐵、檸檬酸鐵等來替代亞硝酸鈉，然而這些物質(zhì)無論在發(fā)色效果、持久性、穩(wěn)定性、防腐、呈味等方面都效果不理想，到目前為止還沒有找到完全替代亞硝酸鈉的添加劑[8-9].因此國內(nèi)外的肉類加工企業(yè)仍采用亞硝酸鈉作為肉品發(fā)色劑來獲得理想的色澤和風(fēng)味，延長保質(zhì)期[10].目前需要解決的問題是如何減少亞硝酸鈉的用量，所以研究亞硝酸鈉的使用量對腌肉制品脂質(zhì)氧化的影響具有十分重要意義.

因此本研究以羊肉作為研究對象，探討腌制過程中不同亞硝酸鈉添加量對羊肉脂肪酸組成以及脂質(zhì)氧化程度的影響，以期能為腌制羊肉制品的脂質(zhì)氧化及質(zhì)量調(diào)控提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗取樣于甘肅省定西市中天羊業(yè)股份有限公司，隨機選取胴體質(zhì)量相近、健康的6～9月齡大尾寒羊9只，屠宰后采集臀肌，將肉樣采集后清洗血液，剔除脂肪、筋膜和結(jié)締組織，瀝干，放入保鮮袋中4 ℃運輸回實驗室.

亞硝酸鈉、乙醇、甲醇、異丙醇、丙二醛、氫氧化鉀、氯化鈉、氯仿、硫氰酸銨、氯化亞鐵、三氯乙酸、正己烷、濃硫酸等均購于天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司，均為分析純.

1.2 儀器

電子天平FA2004B(上海佑科儀器有限公司)；AB-S型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；水浴鍋(北京科偉永興儀器公司)；冰箱(青島海爾電冰箱股份有限公司)；高速臺式離心機GT10-1(北京時代北利離心機有限公司)； 7000D GC-MS聯(lián)用儀(美國Agilent公司)等.

1.3 樣品處理

將羊肉切割成約3 cm×3 cm×3 cm均勻小塊，向其中均勻注射0、50、100、150 mg/kg的NaNO2.隨后置于滾揉機中滾揉12 h，期間每滾揉30 min，靜止30 min，放置在4 ℃的冰箱中腌制，在0、12、24、48、72和168 h時進(jìn)行取樣.其中，色度以及肌紅蛋白含量直接測定，對于不便立即測定的指標(biāo)，用鋁箔紙包裹避光，避免脂質(zhì)光敏氧化的發(fā)生，置于-80 ℃凍藏待測.

1.3.1 色度 肉色采用CR-10型色差儀，將色彩色差計調(diào)至L*、a*、b*色域系統(tǒng)進(jìn)行測定.肉樣沿肌纖維垂直的方向切取厚度不低于2 cm的肉塊，將肉樣新切面朝上平放在托盤上，置4 ℃避光靜置30 min后，在其切面上選取6個點進(jìn)行測定，取平均值[11].因為在弱酸性環(huán)境下亞硝酸呈不穩(wěn)定狀態(tài)，繼續(xù)分解為亞硝基和NO，亞硝基會與肉制品中的肌紅蛋白和血紅蛋白結(jié)合，產(chǎn)生亞硝基肌紅蛋白和亞硝基血紅蛋白，從而使肉品呈現(xiàn)鮮紅色，改變?nèi)馄返腶*值，所以本試驗只測定了a*值.

1.3.2 硫代巴比妥酸值(TBARS) 采用國標(biāo) GB 5009.181-2016[12]測定.

1.3.3 過氧化值(POV) 采用國標(biāo) GB 5009.227-2016[13]測定.

1.3.4 脂肪酸含量 參考O′Fallon等[14]的方法測定，根據(jù)具體情況作稍微的修改.將真空包裝袋中的肉樣在室溫下解凍12 h，用刀剝離并剔除肌肉表面脂肪，將樣品置于研缽中加入液氮研磨，然后稱取1.0 g研磨后的樣品置于具塞試管，分別加入0.7 mL濃度為10 mol/L的KOH溶液和5.3 mL無水甲醇，并在55 ℃恒溫下水浴1.5 h，同時每20 min振搖試管5 s.水浴結(jié)束后，取出試管，在自來水下將其冷卻到低于室溫，然后再加入0.58 mL濃度為12 mol/L的H2SO4溶液，在55 ℃下繼續(xù)恒溫水浴1.5 h進(jìn)行游離脂肪酸甲酯化，同時每20 min振搖5 s.水浴結(jié)束后,取出試管，用自來水將其冷卻至低于室溫，再加入3 mL正己烷搖勻后轉(zhuǎn)移至離心管，以3 000 r/min的速度離心5 min，取上清液，并利用有機相過濾膜將其過濾到樣品瓶，放于-20 ℃待GC檢測.

色譜柱：DB-23石英毛細(xì)管柱(60 m×0.25 mm×0.25μm，美國Agilent公司)；進(jìn)樣口：250 ℃，分流比20∶1；進(jìn)樣量:1 μL；載氣為He氣，柱流速1 mL/min；升溫程序：初溫50 ℃，保持4 min，10 ℃/min升溫至150 ℃，保持4 min，5 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min.

質(zhì)譜條件：離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電子轟擊能70 eV，掃描范圍15～550 m/z，輔助溫度230 ℃.

化合物經(jīng)計算機檢索同時與NIST Library譜庫的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對照，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，確定各揮發(fā)性化合物的化學(xué)成分，僅報道匹配度大于800(最大值1000)的鑒定結(jié)果.

1.3.5 脂質(zhì)氧化產(chǎn)物 參考Alicia等[15]的方法并稍作修改.采用SPME-GC-MS技術(shù)測定樣品中揮發(fā)性化合物的種類及含量.取l0 g肉樣，與1 g NaCl混勻后裝入頂空萃取瓶中密封，80 ℃水浴40 min充分熟制后，將萃取頭插入瓶中萃取40 min，取出萃取頭進(jìn)行GC-MS分析.

色譜條件：色譜柱為Thermo TG-WAX(60 m×0.25 mm，0.5 μm).升溫程序:色譜柱起始柱溫35 ℃，保持5 min，然后以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min.載氣(He)流速0.8 mL/min，不分流.進(jìn)樣解吸溫度240 ℃，解吸2 min.

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，燈絲電流200 μA，接口溫度240 ℃，檢測電壓350 V，掃描質(zhì)量范圍為35～350 m/z.

揮發(fā)性化合物定性與定量：用TuborMass4.1.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，對GC-MS結(jié)果進(jìn)行分析，通過對比系統(tǒng)自帶的NBS、Nist等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行解析，各物質(zhì)峰所得質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根據(jù)其匹配度鑒定各揮發(fā)性化合物.并用相對離子豐度表示各種化合物的相對含量.

1.3.6 肌紅蛋白相對含量測定 參考Krzywicki等[16]的方法略有改動.取肉樣5 g，加入20 mL 0.04 mol/L pH值為6.8的磷酸鈉緩沖液勻漿25 s.勻漿液在4 ℃冰箱中放置1 h，然后在3 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心30 min.上清液經(jīng)濾紙過濾，用同樣的緩沖液補足至25 mL，測定其在525、545、565、572 nm處的吸光度.氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白相對含量計算公式為:

COMb=(0.882A575/A525-1.267A565/A525+0.809A545/A525-0.361)×100%

CMMb=(-2.514A572/A525+0.777A565/A525+0.8A545/A525+1.098) ×100%

式中：COMb：氧合肌紅蛋白相對含量，%；CMMb：高鐵肌紅蛋白相對含量，%；Aλ：相應(yīng)波長下的吸光度

2 結(jié)果與分析

2.1 色度

色澤是反應(yīng)羊肉感官品質(zhì)的重要指標(biāo)，色澤很大程度上影響消費者的喜好[17].a*值的變化與肌紅蛋白(Mb)的含量和化學(xué)狀態(tài)密切相關(guān).由表1可得，a*值在24 h內(nèi)有上升趨勢，24 h后逐漸趨于穩(wěn)定或者下降；且未添加亞硝酸鈉的處理a*值低于添加亞硝酸鈉的處理(P<0.05).這與趙晶[18]不同貯藏條件下羊肉品質(zhì)及其DNA質(zhì)量的研究結(jié)果相似.未添加亞硝酸鈉的肉樣在0～24 h時a*值升高的原因很可能就是因為剛切開的肉放置一段時間，肌肉中的肌紅蛋白與氧氣接觸，變?yōu)檠鹾霞〖t蛋白，肉色表現(xiàn)為鮮紅色；24 h以后肉表面的氧合肌紅蛋白進(jìn)一步被氧化成褐色的高鐵肌紅蛋白，肉的顏色變暗，檢測到的紅度值相對較低；而添加亞硝酸鈉后，肉樣中的肌紅蛋白與亞硝酸鈉反應(yīng)可生成亞硝基肌紅蛋白，呈粉紅色[19]，因此其a*值較未添加亞硝酸鈉的均有所上升.且當(dāng)亞硝酸鈉濃度為100 mg/kg時，a*值更為穩(wěn)定；腌制168 h時，亞硝酸鈉濃度為100 mg/kg的肉樣a*值比未添加組的高39.21%.

表1 腌制過程中亞硝酸鈉對羊肉a*值的影響

2.2 硫代巴比妥酸值(TBARS)

TBARS值表征反應(yīng)中氧化產(chǎn)物MDA(丙二醛)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，與脂肪的氧化程度成正比[20].表2可得，由于脂肪的氧化，羊肉在腌制過程中所有肉樣TBARS值均緩慢升高，這與林玉海[21]的研究結(jié)果相似.而且在整個腌制過程中添加亞硝酸鈉的肉樣TBARS值明顯低于未添加亞硝酸鈉的肉樣，在腌制24 h后各肉樣中MDA含量有顯著性差異(P<0.05)，這可能是由于亞硝酸鈉可以與不飽和脂肪酸反應(yīng)形成穩(wěn)定的脂質(zhì)衍生物抑制脂質(zhì)氧化，不僅提高了肉類產(chǎn)品的穩(wěn)定性，而且可以防止酸敗，延長其保質(zhì)期.當(dāng)亞硝酸鈉的濃度為100 mg/kg時，MDA含量的上升趨勢更為緩慢.腌制168 h時，濃度為100 mg/kg肉樣的MDA含量比未添加的低14.64%.

表2 腌制過程中亞硝酸鈉對羊肉TBARS值的影響

2.3 過氧化值(POV)

過氧化值是表示油脂和脂肪酸氧化程度的一個指標(biāo)[22].由表3可得，由于脂肪的氧化，氫過氧化物含量逐漸增加，羊肉在腌制過程中所有肉樣POV值均緩慢升高，這可能是由于脂肪開始緩慢氧化，氫過氧化物含量逐漸增加.這與劉文營等[23]的研究結(jié)果相似.而在整個腌制過程中添加亞硝酸鈉的肉樣其POV值明顯低于對照組，12 h后均有顯著差異(P<0.05).當(dāng)亞硝酸鈉的濃度為100 mg/kg時，POV值的上升趨勢較其他亞硝組更為緩慢.腌制168 h時，濃度為100 mg/kg肉樣的POV值比未添加的低22.10%.

表3 腌制過程中亞硝酸鈉對羊肉POV值的影響Table 3 Effect of sodium nitrite on the POV value of mutton during pickling

2.4 脂肪酸氧化分析

由TBARS值和POV值可知，當(dāng)亞硝酸鈉添加量為100 mg/kg時，對脂質(zhì)氧化抑制效果最明顯.因此選擇腌制亞硝酸鈉添加量為100 mg/kg、國標(biāo)中亞硝酸鈉添加量的上限150 mg/kg，以及未添加亞硝酸鈉的肉樣測定脂肪酸含量以及脂質(zhì)氧化產(chǎn)物.由表4可知，單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸隨時間的延長其含量逐漸下降；而飽和脂肪酸隨腌制時間的延長其含量逐漸上升，這與Holman等[25]的研究結(jié)果相似.Alicia等[15]研究指出，不飽和脂肪酸含量越高，牛肉中脂質(zhì)越容易發(fā)生氧化，而脂肪含量越高，脂質(zhì)氧化程度越高.腌制時間為168 h時，添加亞硝酸鈉濃度為100 mg/kg的肉樣比未添加的不飽和脂肪酸含量低44.57%，飽和脂肪酸含量高9.51%，這可能是由于亞硝酸鈉與不飽和脂肪酸的碳碳雙鍵發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生穩(wěn)定的脂質(zhì)衍生物，阻止脂質(zhì)的過氧化，因此亞硝酸鈉對脂質(zhì)氧化有一定的抑制作用[26-27].

表4 腌制過程中不同亞硝酸鈉添加量對羊肉脂肪酸含量的影響

2.5 脂質(zhì)氧化產(chǎn)物

羊肉在腌制過程中添加不同濃度亞硝酸鈉對其脂質(zhì)氧化產(chǎn)物的影響見表5.表5中列出了18種相對含量較高且對脂質(zhì)氧化有影響的醛類、酮類和醇類物質(zhì).

醛類主要包括己醛、庚醛、辛醛、壬醛、2-辛烯醛、苯甲醛等11種醛類物質(zhì).醛類化合物是脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的穩(wěn)定產(chǎn)物，其含量的變化可用來評價肉類制品的脂質(zhì)氧化程度[28].醛類化合物中含量較高的為己醛和壬醛，整體含量隨腌制時間的延長呈下降趨勢.己醛是脂質(zhì)氧化過程中重要的氧化產(chǎn)物[29]，隨著腌制時間的延長，己醛含量呈先上升后下降的趨勢，這與Fereidoon等[28]的研究結(jié)果相似.腌制168 h時，添加亞硝酸鈉濃度為100 mg/kg的肉樣比未添加亞硝酸鈉的肉樣低15.24%.

由表5可得，醛、酮類化合物隨腌制時間的延長，其含量呈下降趨勢，而醇類化合物含量呈上升趨勢.且添加亞硝酸鈉的肉樣醛酮類化合物下降趨勢較為緩慢，醇類化合物上升趨勢也較為緩慢，這可能是由于亞硝酸鈉螯合金屬離子而發(fā)揮抗氧化作用所致.

表5 腌制過程中不同亞硝酸鈉添加量對羊肉脂質(zhì)氧化產(chǎn)物相對含量的影響

2.6 肌紅蛋白相對含量

氧合肌紅蛋白和高鐵肌紅蛋白的相對含量決定肉的色澤，當(dāng)高鐵肌紅蛋白含量較高時，肌肉呈現(xiàn)褐色[31].MbO2的含量隨時間的延長呈下降趨勢，在72～168 h，添加亞硝酸鈉的肉樣MbO2含量顯著高于未添加亞硝酸鈉的肉樣，并且168 h時未添加和添加亞硝酸鈉的MbO2與0 h的相比分別降低了57.0%和44.6%(P<0.05)，說明亞硝酸鈉可以抑制MbO2的氧化.而MetMb的相對含量隨時間的延長呈先上升后下降的趨勢，在48 h時MetMb含量最高，未添加和添加亞硝酸鈉的MetMb與0 h的相比分別升高了64.8%和37.8%(P<0.05)，且未添加亞硝酸鈉的MetMb相對含量高于添加亞硝酸鈉的肉樣，這可能是由于亞硝酸鈉分解為NO，與Fe連接，穩(wěn)定Hb和Mb的結(jié)構(gòu)，防止其氧化分解.說明亞硝酸鈉可有效減緩肌紅蛋白高鐵氧化.這一結(jié)果與前面a*值的變化趨勢一致.

表6 腌制過程中亞硝酸鈉對羊肉肌紅蛋白相對含量的影響

3 結(jié)論

經(jīng)添加亞硝酸鈉腌制的羊肉在4 ℃條件下可以有效降低脂質(zhì)氧化速率，延長貨架期.隨著腌制時間的延長，不同亞硝酸鈉添加量肉制品的脂質(zhì)氧化程度存在顯著性差異，其中亞硝酸鈉添加量為100 mg/kg的脂質(zhì)氧化程度最低.因此在羊肉腌制過程中添加亞硝酸鈉可有效抑制脂質(zhì)氧化，且當(dāng)亞硝酸鈉的添加量為100 mg/kg時效果較為顯著.