牛骨膠原蛋白肽制備工藝優(yōu)化及抗氧化活性分析

魏潔瓊，余群力，韓玲，韓廣星，張新軍，曹暉，羅小嬋

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.山東綠潤(rùn)食品有限公司，山東 臨沂 276000；3.寧夏夏華肉食品有限公司，寧夏 中衛(wèi) 751700；4.陜西秦寶牧業(yè)股份有限公司，陜西 寶雞 721000)

膠原蛋白是由動(dòng)物細(xì)胞合成的一種生物性高分子[1]，是維持正常組織構(gòu)造和性能的必要成分[2]，具有良好的生物化學(xué)和生物相容性[3].膠原蛋白肽是膠原蛋白在一定的外部條件下發(fā)生水解后得到的產(chǎn)物，與膠原蛋白相比食用后利用率較高，易被人體吸收.國內(nèi)外許多研究表明，膠原蛋白肽可能有助于預(yù)防老年動(dòng)脈粥樣硬化[4]，促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)[3]，長(zhǎng)期攝入可能改變消化道的外型或內(nèi)型蛋白酶活性，從而有益身體健康[5].

隨著我國肉牛養(yǎng)殖的集約化和肉類加工業(yè)的發(fā)展，肉牛屠宰加工副產(chǎn)物也隨之增加，牛骨是其中主要的副產(chǎn)物之一，其含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂肪等營(yíng)養(yǎng)成分，其中膠原蛋白為骨源蛋白質(zhì)的主要成分[6].因此，從牛骨中提取膠原蛋白并進(jìn)一步制備成膠原蛋白肽，是一個(gè)具有開發(fā)潛力的科技成果轉(zhuǎn)化途徑，且綜合利用骨副產(chǎn)物不僅可以減少環(huán)境污染，還具有很高的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益[7].

目前國內(nèi)外已有不少關(guān)于膠原蛋白肽功能特性的研究報(bào)道：雞胸骨膠原蛋白肽具有抗氧化、抗炎和抑制軟骨細(xì)胞凋亡的作用[8]；阿拉斯加鱈皮膠原蛋白肽對(duì)燒傷后小鼠的腸道緊密連接有保護(hù)作用[9]；超濾法分離得到分子量小于3 ku的豬骨膠原多肽原溶液，其蛋白質(zhì)濃度最低，但ACE抑制率最高[10].李嬌嬌[11]采用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶優(yōu)化鵝骨抗氧化肽的制備工藝并對(duì)其分離純化，得到了小于5 ku的鵝骨抗氧化肽，該肽具有很高的超氧陰離子自由基清除能力.張康華等[12]采用雙酶分步酶解制備的豬皮膠原蛋白肽在體內(nèi)外均有不同程度的抗氧化能力，且分子量越小抗氧化活性越強(qiáng).通過對(duì)前人研究的總結(jié)發(fā)現(xiàn)，目前關(guān)于牛骨膠原蛋白肽的提取及不同分子量肽組分抗氧化性的報(bào)道還相對(duì)較少.因此，本研究以牛骨為原料，篩選酶解效果最優(yōu)的酶，對(duì)酶添加量、酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并在此基礎(chǔ)上優(yōu)選試驗(yàn)因素，利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)得出牛膠原蛋白肽的最佳提取條件，并對(duì)不同分子量的肽組分的抗氧化活性進(jìn)行研究，以期使現(xiàn)有的牛骨資源得到充分利用，變廢為寶，為牛骨產(chǎn)品的深度開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑 牛骨原料采購于寧夏夏華肉食品有限公司，隨機(jī)選取發(fā)育正常、健康無病的牛腿骨，剔除筋肉等，切成塊狀于-80 ℃冷凍貯存.

2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)，上海麥克林生化科技有限公司；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶，日本Solarbio公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.1.2 儀器與設(shè)備 LHS-150SC電熱恒溫干燥箱，上海一恒科技有限公司；FA1-204B型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；pHS-3C酸度計(jì)，德國儀表有限公司；HH-2型電熱恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；UV-2450紫外分光光度儀，上海光譜儀器有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 骨膠原蛋白肽制備的工藝流程 牛骨→脫脂→脫鈣→酸溶酶法提取膠原蛋白→酶解→超濾分段→凍干→多肽.

1.2.2 酶的篩選 分別在同等酶添加量3%和同等酶活力10 000 U/g條件下對(duì)膠原溶液進(jìn)行酶解，以多肽提取率為指標(biāo)，選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶在各自理論最適條件下進(jìn)行酶解，通過對(duì)比優(yōu)選效果最佳的酶.

稱取牛骨膠原蛋白用磷酸鹽緩沖液溶解配制成80 g/L的膠原溶液作為底物.按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋至各自理論最適溫度，加入酸或堿調(diào)節(jié)溶液pH值至各自理論最適pH值，加入酶進(jìn)行酶解.酶解到達(dá)預(yù)定時(shí)間后，沸水浴滅酶5 min終止反應(yīng)，迅速冷卻至室溫后，以4 000 r/min離心15 min，取上清液備用.

表1 各種酶的最適條件

1.2.3 酶解單因素試驗(yàn) 堿性蛋白酶在骨膠原蛋白質(zhì)量濃度80 g/L、酶解溫度50 ℃、pH 9.0、酶添加量3.0%、酶解時(shí)間4 h的條件下，設(shè)置酶添加量(2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%)、酶解時(shí)間(2、3、4、5、6、7 h)、pH值(7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)、酶解溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)為因素，改變其中一個(gè)因素，保持其他因素不變，以多肽提取率為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn).

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶添加量(A)、酶解時(shí)間(B)、pH值(C)、酶解溫度(D)為影響因素，以多肽提取率為響應(yīng)值進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn).

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平

1.2.5 多肽提取率的測(cè)定 參考程妍[13]的方法略作修改.

1.2.6 多肽分子量分段 使用裝有截留分子量為10、3 ku超濾膜的Amicon-Ultra-15超濾離心管對(duì)骨膠原蛋白酶解液進(jìn)行分離，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為6 500 r/min，離心時(shí)間40 min.分別收集3個(gè)組分：分子量大于10 ku的組分Ⅰ、分子量在3～10 ku范圍內(nèi)的組分Ⅱ以及分子量小于3 ku的組分Ⅲ，將所得的各個(gè)組分冷凍干燥.

1.2.7 抗氧化性測(cè)定

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參考劉倩霞等[14]方法并略作調(diào)整.以95%乙醇溶解DPPH，配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液.將2 mL樣品溶液與2 mL DPPH溶液于漩渦震蕩儀混合均勻，室溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.按下列公式計(jì)算：

式中：Ai為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度；Aj為2 mL樣品溶液+2 mL 95%乙醇溶液的吸光度，Ao為2 mL DPPH溶液+2 mL 95%乙醇溶液的吸光度.

1.2.7.2 超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定 采用ALI、Li X C等[15-16]的方法，略有改動(dòng).取樣品溶液0.2 mL與5.6 mL 0.05 mol/L Tris-Hcl緩沖液(pH 8.2)混勻后，再加入0.1 mL鄰苯三酚溶液(用0.01 mol/L HCl配制成0.003 mol/L，25 ℃水浴預(yù)熱)于漩渦振蕩儀反應(yīng)30 s后，在325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定30 s時(shí)的吸光度A1，300 s時(shí)的吸光度A2；蒸餾水取代樣品溶液作空白組.用5.6 mL Tris-Hcl緩沖液、0.2 mL蒸餾水和0.2 mL 0.01 mol/L HCl的混合液調(diào)零.按下列公式計(jì)算：

式中：ΔAs=A2-A1；ΔA0為空白組吸光度.

1.2.7.3 羥自由基清除能力的測(cè)定 參照李嬌嬌[11]方法，取9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液各1 mL，在反應(yīng)體系中加入1 mL樣品溶液，加入l mL 8.8 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，37℃保溫30 min.空白組加入1mL蒸餾水替換同體積的樣品溶液.以蒸餾水為參比液，在510 nm下測(cè)定吸光值.按下列公式計(jì)算：

式中：Ao為空白對(duì)照液的吸光度；Ax為加入樣品溶液后的吸光度；ΔAxo為酶解液的本底吸光度.

1.2.7.4 還原力的測(cè)定 參考Gu F L等[17]的方法.取1 mL樣品，與2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 6.6)、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液混勻，50 ℃水浴20 min，迅速冷卻后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清液，依次加入0.5 mL 0.1% FeCl3溶液、2.5 mL蒸餾水，室溫下靜置10 min，于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度.樣品的吸光值越大，說明其還原能力越強(qiáng).

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述測(cè)定至少重復(fù)3次試驗(yàn)，數(shù)據(jù)使用Microsoft Excel 2010軟件整理，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 酶的篩選

由圖1可知，不同蛋白酶對(duì)骨膠原蛋白的酶解效果差異顯著，這可能由于不同蛋白酶作用位點(diǎn)不同.經(jīng)過方差顯著性分析表明，在相同酶濃度和相同酶活力條件下，堿性蛋白酶的多肽提取率均較高.因此認(rèn)為，堿性蛋白酶為骨膠原蛋白肽制備過程中酶解效果最優(yōu)的酶.

不同小寫字母代表差異顯著性(P<0.05).The different small letters show significant difference(P<0.05).圖1 各蛋白酶酶解效果比較Figure 1 Enzymatic effects of different kinds of enzymes

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2-A可見，堿性蛋白酶在酶添加量為3%時(shí)達(dá)到最大值15.11%，多肽提取率高于或低于3%均有下降.這可能是由于在底物濃度足夠的條件下，適宜的酶和底物能夠充分結(jié)合、反應(yīng)完全，所以在一定的水解時(shí)間內(nèi)，多肽提取率也隨之增加.當(dāng)酶添加超量時(shí)，超量部分酶無法與底物結(jié)合，且可能對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用.

如圖2-B所示，在酶解2～5 h內(nèi)，多肽提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，6 h時(shí)多肽提取率最大，達(dá)到了6.88%，但與5 h 時(shí)多肽提取率6.68%相比差異不顯著，并逐漸趨于穩(wěn)定.為節(jié)省成本，酶解時(shí)間為5 h較為適宜.

由圖2-C可知，當(dāng)水解液pH值在7.5～9.0范圍內(nèi)，多肽提取率隨pH的增大而增大(P<0.05)，pH 9.0時(shí)達(dá)最大值7.86%；隨著pH值的不斷增大，多肽提取率開始下降.這可能是不適宜的環(huán)境導(dǎo)致酶的空間構(gòu)造發(fā)生變化，使部分酶活性降低所致.

圖2-D表明，當(dāng)溫度在30～45 ℃范圍，多肽提取率隨溫度的上升而增大(P<0.05)，在50 ℃時(shí)達(dá)最大值11.71%之后；隨著溫度的逐漸升高，多肽提取率開始下降.這可能是由于溫度升高使酶發(fā)生了部分變性，從而抑制了反應(yīng)的進(jìn)行.

圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果Figure 2 Results of single factor experiments

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

利用Design-Expert 8.0設(shè)計(jì)軟件，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，對(duì)酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果見表3，由此獲得二次回歸方程：

多肽提取率/%=12.76+0.12A+0.100B+0.002C+0.15D-0.20AB-0.13AC+0.11AD-0.11BC+0.50BD+0.22CD-1.154A2-1.18B2-1.30C2-1.22D2

表3 堿性蛋白酶響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4 堿性蛋白酶二次回歸方程模型方差分析

綜合單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，得到堿性蛋白酶制備骨膠原蛋白肽的優(yōu)化工藝參數(shù)為酶添加量3.03%、酶解時(shí)間5.01 h、pH值9.0、酶解溫度50.35 ℃，預(yù)測(cè)多肽提取率為12.76%.為使實(shí)際應(yīng)用過程中操作方便，將工藝參數(shù)修正為酶添加量3.0%、酶解時(shí)間5.0 h、pH值9.0、酶解溫度50.4℃，在此條件下得到多肽提取率為12.45%，實(shí)際值與理論值基本相符，說明模型對(duì)堿性蛋白酶酶解骨膠原蛋白工藝參數(shù)優(yōu)化可行，具有一定的實(shí)用價(jià)值.

2.4 抗氧化性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 由圖3可知，所有組分清除DPPH自由基的能力隨著各自濃度的升高而增強(qiáng).在濃度為5 mg/mL時(shí)，DPPH自由基抑制順序?yàn)椋航M分Ⅲ>組分Ⅱ>組分Ⅰ>酶解液，清除率分別為(48.90±1.73)%，(44.99±1.47)%，(38.56±1.59)%和(25.52±1.19)%.結(jié)果表明，所有分級(jí)組分(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)均比酶解液具有更高的清除率，且分子量越小DPPH自由基清除能力越好.

不同大寫字母代表組內(nèi)差異顯著；不同小寫字母代表組間差異顯著(P<0.05).The different capital letter means difference in the same group(P<0.05)；The different small letter means difference between groups(P<0.05).圖3 不同分子量對(duì)DPPH自由基清除能力的影響Figure 3 Effects of DPPH radical scavenging activity of different molecular weights

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，其醇溶液呈深紫色，當(dāng)其遇到提供質(zhì)子的底物(如抗氧化劑)時(shí)，自由基被清除并且吸收率降低[18]，從而使溶液顏色從深紫色變?yōu)辄S色，接受電子或氫原子成為穩(wěn)定的抗磁性分子[19].試驗(yàn)結(jié)果表明，牛骨膠原蛋白肽具有較強(qiáng)的清除DPPH的能力.

2.4.2 超氧陰離子自由基清除能力 超氧陰離子是人體內(nèi)產(chǎn)生的一種活性氧自由基，過多的超氧陰離子將會(huì)損傷細(xì)胞、破壞人類機(jī)體生理功能[20].由圖5可見，超氧陰離子的清除能力隨著濃度的升高而增大，與其他抗氧化指標(biāo)相同，在組分Ⅲ(M<3 ku)時(shí)具有最好清除效果.結(jié)果表明，水解產(chǎn)物分級(jí)的超氧陰離子清除率值明顯高于原始酶解液，組分Ⅲ具有比組分Ⅰ和組分Ⅱ更好的清除能力.當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，組分Ⅲ的超氧陰離子清除率高達(dá)(51.13±1.63)%，其次是組分Ⅱ(45.94±1.53)%和組分Ⅰ(42.503±1.56)%.結(jié)果表明，牛骨多肽的抗氧化活性與其濃度和分子量均密切相關(guān).

不同大寫字母代表組內(nèi)差異顯著；不同小寫字母代表組間差異顯著(P<0.05).The different capital letter means difference in the same group(P<0.05)；The different small letter means difference between groups(P<0.05).圖4 不同分子量對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的影響Figure 4 Effects of superoxide anion radical activity of different molecular weights

2.4.3 羥自由基清除能力 活性氧自由基是不穩(wěn)定的，易與體內(nèi)的其他基團(tuán)或物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，甚至導(dǎo)致疾病[21].因此，去除羥基自由基可能是一個(gè)生物體對(duì)各種疾病最有效的防御之一.由圖5可知，牛骨多肽對(duì)羥自由基的清除能力呈濃度依賴性，隨著濃度的增大，其清除能力呈上升趨勢(shì).試驗(yàn)結(jié)果顯示，各組分對(duì)羥自由基影響順序?yàn)椋航M分Ⅲ>組分>Ⅱ組分Ⅰ>酶解液，并且表明不同分子量牛骨多肽對(duì)羥自由基清除存在量效關(guān)系.多肽濃度為 5 mg/mL 時(shí)，各組分的清除率達(dá)到最高，分別為(87.31±1.76)%、(85.83±1.41)%、(82.51±0.93)%、(70.86±1.08)%.

不同大寫字母代表組內(nèi)差異顯著；不同小寫字母代表組間差異顯著(P<0.05).The different capital letter means difference in the same group(P<0.05)；The different small letter means difference between groups(P<0.05).圖5 不同分子量對(duì)羥自由基清除能力的影響Figure 5 Effects of Hydroxyl radical scavenging activity of different molecular weights

2.4.4 還原力 還原力測(cè)定通常用于評(píng)估天然抗氧化劑提供電子或氫的能力，與其抗氧化性呈正相關(guān)[22].由圖6可知，多肽濃度越高，還原力越大，抗氧化能力越強(qiáng).酶解液在0.1 mg/mL時(shí)吸光度為0.099，5.0 mg/mL時(shí)為0.112，增大了11.6%，組分Ⅲ在0.1 mg/mL時(shí)吸光度為0.119，5.0 mg/mL達(dá)到0.142，增大了16.2%.在相同多肽濃度下，組分Ⅲ的增加趨勢(shì)顯著優(yōu)于酶解液.酶解后的產(chǎn)物能夠提高還原力是由于其中存在的抗氧化肽能夠?qū)㈣F氰化鉀中的Fe3+還原成Fe2+，并進(jìn)一步生成普魯士藍(lán)，通過測(cè)定700 nm處的吸光度可間接反映出水解物的還原能力[23].

不同大寫字母代表組內(nèi)差異顯著;不同小寫字母代表組間差異顯著(P<0.05).The different capital letter means difference in the same group(P<0.05)；The different small letter means difference between groups(P<0.05).圖6 不同分子量對(duì)還原力的影響Figure 6 Effects of Reducing power of different molecular weight

3 討論

牛骨膠原蛋白肽制備過程受酶添加量、酶解時(shí)間、pH值、酶解溫度等因素的影響，在一定的條件范圍內(nèi)，肽提取率會(huì)隨影響因素的變化而變化.本研究中肽提取率隨酶添加量的增加呈先增高后降低的趨勢(shì)，這與朱瀛等[24]研究的木瓜蛋白酶水解雞骨泥制備短肽中結(jié)果相似，可能原因是在底物濃度足夠的條件下，適宜的酶和底物能夠充分結(jié)合、反應(yīng)完全，所以在一定時(shí)間內(nèi)，肽提取率也隨之增加；當(dāng)酶添加超量時(shí)，超量部分酶無法與底物結(jié)合，且可能對(duì)反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用.試驗(yàn)中隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，肽提取率呈先升高后逐漸穩(wěn)定的趨勢(shì)，這可能由于在酶解初期，暴露的酶切位點(diǎn)較多，利于水解反應(yīng)的進(jìn)行，使得肽提取率升高，但隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，可供酶切的位點(diǎn)減少，不能有效地促進(jìn)酶與底物的結(jié)合，導(dǎo)致水解反應(yīng)放緩[14].試驗(yàn)中酶解溫度的升高使得肽提取率先上升后下降，此結(jié)果與徐榮榮等[25]研究的超聲波輔助酶法水解酪蛋白工藝優(yōu)化結(jié)果相似，這可能由于酶解溫度升高，酶作用位點(diǎn)釋放，加速了底物蛋白和酶的反應(yīng)，促進(jìn)水解進(jìn)程，使肽片段暴露；當(dāng)溫度繼續(xù)升高使得酶的活性中心發(fā)生構(gòu)象的改變，酶被破壞[26]，肽提取率下降.試驗(yàn)中隨著pH值的增大，肽提取率隨之先增加后緩慢降低，這可能是不適宜的環(huán)境導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使部分酶活性降低.本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)得到最佳酶解條件為酶添加量3%、酶解時(shí)間5 h、pH 9.0、酶解溫度50.4℃，該條件下進(jìn)行酶解驗(yàn)證得到提取率為12.45%，結(jié)果較優(yōu)化之前顯著提高，說明堿性蛋白酶可有效酶解骨膠原蛋白，且該方法簡(jiǎn)單易操作，成本低廉，有利于骨資源的合理利用.

本試驗(yàn)通過對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定，評(píng)價(jià)各組分肽的抗氧化活性，分析了不同分子量肽段的抗氧化活性.結(jié)果表明，不同分子量的肽段均對(duì)DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基具有良好的清除能力，并有較強(qiáng)的還原能力.其中DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除活性與徐兆剛等[27]研究的河蚌蛋白抗氧化肽相比較弱，這可能是因?yàn)樵虾兔阜N類的不同造成所提取的物質(zhì)濃度不同，從而影響其抗氧化活性；羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力與張康華等[12]提取的豬皮膠原肽清除能力相當(dāng)，但DPPH自由基清除率相對(duì)較弱，這可能由于雙酶酶解得到的膠原肽分子量更小，具有更好的DPPH自由基清除活性.還原力與葛曉鳴[28]等研究的海馬酶解多肽還原力一致，分子量愈小還原力愈大.由此可見，骨膠原蛋白多肽具有一定的抗氧化活性，目前提取的膠原蛋白肽是多種肽的混合物，今后需對(duì)其分離、純化及活性進(jìn)行深入研究.

4 結(jié)論

1) 優(yōu)選得到具有最佳酶解效果的堿性蛋白酶，其酶解工藝條件為：酶添加量3%、酶解時(shí)間5 h、pH 9.0、酶解溫度50.4 ℃，在此條件下膠原蛋白肽提取率為12.45%，結(jié)果較優(yōu)化之前顯著提高.

2) 超濾得到的3種不同分子量的肽組分均具有抗氧化活性，其中組分Ⅲ(M<3 ku)的抗氧化活性最強(qiáng)，組分Ⅱ(10 ku10 ku)最弱.

3) 本研究既充分利用了牛骨中的蛋白質(zhì)資源，也為肉牛屠宰加工副產(chǎn)物牛骨的精深加工提供了新思路和新方法.