高通量農(nóng)業(yè)基因工程技術(shù)VIGS的應(yīng)用研究

焦健 張紅培

摘要：農(nóng)作物新品種的培育過程中，常常涉及到生物基因工程技術(shù)的使用，比如轉(zhuǎn)基因作物新品種、分子設(shè)計(jì)育種、基因編輯育種等。VIGS技術(shù)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用中一種反向遺傳學(xué)的基因工程技術(shù)，它一般根據(jù)具體育種目標(biāo)，構(gòu)建精準(zhǔn)的基因沉默病毒載體，最終結(jié)合育種實(shí)踐培育出符合預(yù)期的農(nóng)作物新品種。該文研究了一種高通量的農(nóng)業(yè)基因工程技術(shù)VIGS在農(nóng)作物育種中的基因篩選應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：VIGS（基因沉默）;高通量;農(nóng)業(yè)基因工程;技術(shù)應(yīng)用

1 ? VIGS技術(shù)簡介

由于農(nóng)作物突變體的收集獲得較難，病毒誘導(dǎo)的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)已經(jīng)成為一種有效的研究功能基因組學(xué)的反向遺傳學(xué)工具，而且VIGS是農(nóng)作物基因組功能分析的重要基因工程技術(shù)手段。VIGS一般是在已改造、優(yōu)化的病毒載體中，插入適當(dāng)大小的目的基因cDNA片段，隨著病毒侵染寄主并在農(nóng)作物組織中大量繁殖后，病毒載體中的目的cDNA片段在農(nóng)作物體內(nèi)利用siRNA的生物合成途徑產(chǎn)生針對靶標(biāo)基因的多種siRNA，繼而通過siRNA干涉機(jī)制，降解靶標(biāo)基因的mRNA，最終實(shí)現(xiàn)對目的基因轉(zhuǎn)錄水平的沉默或翻譯水平的抑制[1]。農(nóng)作物VIGS的基本過程包含以下幾個方面：1）病毒載體（已插入被沉默目的基因cDNA片段）的構(gòu)建;2）寄主農(nóng)作物的病毒侵染（如穿刺法、注射法、高壓法和真空滲透法等）;3）寄主農(nóng)作物天然VIGS防御體系針對入侵病毒，產(chǎn)生sRNA并啟動sRNA對目的基因的干涉機(jī)制[2]。

2 ? VIGS技術(shù)在農(nóng)業(yè)基因工程應(yīng)用中的優(yōu)勢

相比較其他可導(dǎo)致目標(biāo)基因沉默或功能抑制的技術(shù)方法，VIGS技術(shù)在農(nóng)業(yè)基因工程的實(shí)際應(yīng)用中，具有以下6個方面的優(yōu)勢：1）快速簡單、操作方便、實(shí)驗(yàn)周期短;（2）不需要繁瑣且周期長的遺傳轉(zhuǎn)化，當(dāng)代就能觀察農(nóng)作物目標(biāo)基因沉默的表型及進(jìn)一步的分子鑒定;3）只需利用目標(biāo)基因的一段cDNA片段就能將該目標(biāo)基因沉默，無需知道基因的完整編碼序列;4）對同源性較高的一類基因家族成員，可選擇高度保守的區(qū)域用以沉默整個家族成員，也可以選擇非保守區(qū)域用以沉默其中某個家族成員;5）由于有些農(nóng)作物育種突變體的收集獲得較難，而且對于某些沉默致死或不育的基因，也可以利用VIGS的方法來實(shí)現(xiàn)對這類基因的功能分析;6）瞬時VIGS技術(shù)可用于高通量地篩選分析基因的功能以及可在不同農(nóng)作物種間完成比較基因?qū)W的快速研究[3]。由此可見，VIGS技術(shù)具備了上述實(shí)驗(yàn)方法和操作上的優(yōu)勢，使其成為一種有效地篩選農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)育種基因、研究農(nóng)作物新基因功能的反向遺傳學(xué)工具。

3 ? 高通量VIGS技術(shù)在農(nóng)作物基因功能檢測中的應(yīng)用

本研究以八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）基因?yàn)檠芯繉ο?，該基因的沉默可?dǎo)致植物葉片及莖桿組織失綠，即光漂白表型。因此，在實(shí)施瞬時基因沉默實(shí)驗(yàn)時，往往以PDS基因作為標(biāo)志性基因或陽性對照。此外，我們利用Web MicroRNA Designer 3（http：//wmd3.weigelword.org，WMD3）平臺設(shè)計(jì)沉默麥類作物PDS基因的amiRNAs_PDS，WMD3網(wǎng)絡(luò)工具由Weigel創(chuàng)建，以便于設(shè)計(jì)、選擇適當(dāng)?shù)腶miRNA序列，并且提供了AtmiR319和OsmiR528等常用miRNA前體相關(guān)的引物，使amiRNA的構(gòu)建更加快捷。

本研究建立了基于BSMV的vamiRNAs表達(dá)系統(tǒng)，我們選擇了單、雙子葉植物不同的miRNA前體為骨架以表達(dá)這些vamiRNA_PDS，探索amiRNA的設(shè)計(jì)和選擇標(biāo)準(zhǔn)。另外，以單、雙子葉植物不同的miRNA前體為骨架，攜帶可誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生光漂白表型的vamiRNA_PDS，比較分析同源或異源的不同miRNA前體在麥類作物中表達(dá)vamiRNAs的情況。實(shí)驗(yàn)采用來源不同的5個miRNA前體，他們分別是OsaMIR528，AthMIR319a，TaeMIR171a，HvuMIR168和HvuMIR171前體，其中OsaMIR528和AthMIR319a前體相對于小麥而言是外源miRNA前體，而且AthMIR319a前體相對于小麥來說又是雙子葉植物的miRNA前體，其他前體均屬于單子葉植物自大麥或小麥內(nèi)源的miRNA前體。

以BSMV表達(dá)vamiR_TaPDS為例，利用End-point Stem-loop RT-PCR技術(shù)檢測不同miRNA前體表達(dá)vamiR_TaPDS的相對轉(zhuǎn)錄水平，圖1-A是該技術(shù)原理的示意圖。如圖1-C所示，半定量RT-PCR利用Stem-loop引物分別擴(kuò)增vamiRNA 23、26和29循環(huán)后，可檢測到不同miRNA前體在小麥葉片中均可切割產(chǎn)生vamiRNA。結(jié)合Real-time RT PCR（圖1-B），檢測不同miRNA前體在小麥中的切割效率，發(fā)現(xiàn)OsaMIR528前體可表達(dá)出較多的vamiRNA。另外，來源單、雙子葉植物不同的miRNA前體均可誘導(dǎo)小麥葉片光漂白表型（圖1-D）。

因此，BSMV病毒載體攜帶內(nèi)源miRNA前體，可以在普通小麥中表達(dá)vamiRNA，即“與amiRNA序列相同的sRNA”;并且OsaMIR528前體相對本實(shí)驗(yàn)其他miRNA前體，表達(dá)vamiRNA的效率更高。可見，利用BSMV病毒載體的VIGS技術(shù)，可以高通量沉默目標(biāo)基因，檢測目標(biāo)基因的功能，這就為農(nóng)業(yè)實(shí)際育種過程中，高通量篩選目標(biāo)基因提供了瞬時、快速和便利技術(shù)手段。

4 ? 結(jié)語

與發(fā)達(dá)國家相比，中國農(nóng)業(yè)育種技術(shù)還有差距，需要我們創(chuàng)新育種理念，補(bǔ)上短板，突破傳統(tǒng)育種技術(shù)的限制，走出多種基因工程育種技術(shù)的新路，為保障中國糧食安全提供核心戰(zhàn)略支撐。當(dāng)前基因工程育種技術(shù)的重點(diǎn)在于解析復(fù)雜性狀分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，闡明其相互效應(yīng)，構(gòu)建具有育種價(jià)值的分子模塊系統(tǒng)，建立模塊耦合組裝的理論和應(yīng)用模型，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效多模塊的有效組裝，創(chuàng)建新一代超級品種培育的系統(tǒng)解決方案和育種新技術(shù)。

目前，先進(jìn)的表達(dá)小分子RNA的VIGS技術(shù)，可以用于農(nóng)作物新品種目標(biāo)基因的高通量沉默和篩選，該項(xiàng)技術(shù)具有瞬時性、便捷性、快速性和高通量等優(yōu)點(diǎn)[4]。本研究通過利用BSMV病毒載體，在麥類作物中表達(dá)了vamiRNA，建立了基于BSMV病毒載體的sRNA表達(dá)系統(tǒng)，為篩選育種目標(biāo)基因和研究麥類作物靶標(biāo)基因的功能提供了反向遺傳學(xué)方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]Jiao，J.;Wang，Y.C.;Selvaraj，S.N.;Xing，F(xiàn).G.;Liu，Y.Barley stripe mosaic virus （BSMV）induced microRNA silencing in common wheat（Triticum aestivum L.）.PLoS ONE 2015， 10，e0126621.

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[4]Cai，Q.;Qiao，L.;Wang，M.;He， B.; Lin， F.M.;Palmquist，J.;Huang，S.D.;Jin，H. Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes. Science 2018，360，1126–1129.