響應(yīng)面法優(yōu)化臭靈丹中異綠原酸B的提取工藝研究

李玉蓉 彭誠(chéng) 柳絲瑤 單亮

【摘 ? 要】 為了優(yōu)化臭靈丹中異綠原酸B的提取工藝，在前期單因素試驗(yàn)對(duì)功率、時(shí)間、料液比、乙醇濃度四個(gè)影響提取因素比較的基礎(chǔ)上，應(yīng)用HPLC法測(cè)定含量，通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了響應(yīng)面法分析。結(jié)果得出：異綠原酸B的最佳提取工藝為超聲功率300w，超聲時(shí)間51minn，料液比38：1 g/mL，乙醇濃度為74%，其得率為1.598%。

【關(guān)鍵詞】 臭靈丹草;異綠原酸B;HPLC響應(yīng)曲線法

中圖分類號(hào)：R284.2 ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)識(shí)別碼：A ? ? ? ? ? ? ? 文章編號(hào)：2096-1073（2020）10-0034-36

[Abstract] In order to optimize the extraction process of iso-chlorogenic acid B from Odorant panacea， on the basis of the comparison of four factors affecting the extraction， namely power， time， solid-liquid ratio and ethanol concentration， HPLC method was used to determine the content， and response surface method was used to analyze the data through box-Behnken experiment. The results showed that the optimal extraction technology of iso-chlorogenic acid B was ultrasonic power 300w， ultrasonic time 51minn， solid-liquid ratio 38：1 g/mL， ethanol concentration of 74%， and yield of 1.598%.

[Key words] panacea purpurea; isochlorogenic acid B; HPLC response curve method

臭靈丹草，學(xué)名（Laggera pterodonta），在民間被稱為臭葉子、大黑藥等，為菊科翼齒六棱菊的全草，洗凈后干燥入藥。它是云貴川地區(qū)常見(jiàn)的中草藥，其味苦、辛，性寒，具有非常高的藥用價(jià)值，近年來(lái)逐漸應(yīng)用于臨床中，可治療急性呼吸道感染、感冒和甲型H1N1流感等，對(duì)治療多類病毒有明顯功效。據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，水提物中的二咖啡?？崴峤Y(jié)構(gòu)對(duì)單純皰疹病毒Ⅰ型，單純皰疹病毒Ⅱ型以及流感病毒ⅣA所致的細(xì)胞病變有抑制作用[1]。因此，探究臭靈丹中二咖啡酰奎尼酸的含量和功效具有重大意義，該試驗(yàn)主要針對(duì)臭靈丹中異綠原酸B（3，4-二咖啡酰奎尼酸）的提取工藝進(jìn)行研究。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗(yàn)材料

臭靈丹草采于云南省石林彝族自治縣周邊;異綠原酸B標(biāo)準(zhǔn)品由成都曼思特公司購(gòu)買;實(shí)驗(yàn)所需儀器、用具、試劑、藥品等均由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院制藥工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 ?試驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC化合物含量測(cè)定 ?HPLC條件：型號(hào)為Inertsil ODS-SP色譜柱（4.6×150 mm，5 μm）;流動(dòng)相為0.1%乙酸水（A）-甲醇（B）洗脫梯度 （0～5min，20%～35%B，5～13min，35%～50%B， 13～18min，50%～80%B，8～40min，80%～20%B），檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm，柱溫30℃，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量20 μL。

標(biāo)準(zhǔn)品的制備：在弱光線的環(huán)境下，分別取10mL棕色瓶放入標(biāo)準(zhǔn)品B 3.7 mg，加100%甲醇溶解并定容，制成每1mL含0.37mg的異綠原酸B溶液，置于2-8℃下待用。

供試品的配置：將臭靈丹粉末過(guò)40目篩，稱取全草粉末1.000 g放入錐形瓶，倒入甲醇溶液至刻度線，準(zhǔn)確稱重，在功率300w、頻率50kHz條件下，對(duì)藥材進(jìn)行超聲處理1h，冷卻后補(bǔ)充缺少重量，備用。

1.2.2 線性回歸方程 ?標(biāo)準(zhǔn)品溶液移入25mL容量瓶中，分別加入甲醇溶液稀釋至2、4、6、8、10 倍，定容后根據(jù)1.2.1方法進(jìn)樣測(cè)定峰面積，得出異綠原酸B的線性關(guān)系為：Y=97164440X-2184，線性范圍0.02～0.10 mg/mL，R2=0.9998。

1.2.3 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì) ?通過(guò)該試驗(yàn)前期階段的單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，選擇出條件較好的三個(gè)水平，借助Box-Benhnken模型建立與分析四項(xiàng)因素，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平，見(jiàn)表1。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?異綠原酸B的方差分析

借助Box-Benhnken模型，對(duì)異綠原酸B提取試驗(yàn)進(jìn)行了Box-Behnken設(shè)計(jì)，針對(duì)結(jié)果分析得出響應(yīng)面模型的回歸方程：

Y1 =+1.558-7.75A+0.1001B+0.0332C-0.014D+0.0202AB+0.1307AC+0.0437AD+0.0425BC-0.0297BD-0.052CD-0.1259A2-0.1113B2-0.1412C2-0.1568D2

異綠原酸B的方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可得出，衡量控制組與實(shí)驗(yàn)組差異大小的P值小于0.01，F(xiàn)b=22.15，表明模型擬合方程顯著，根據(jù)兩模型失擬項(xiàng)的方差分析，P>0.05，F(xiàn)b=3.337，失擬項(xiàng)不顯著，實(shí)驗(yàn)數(shù)值之間差異小，方程式可以完全反映實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況。試驗(yàn)所選模型的決定系數(shù)R2=0.9668，變異系數(shù)（C V%）=3.13，表明其擬合程度良好，測(cè)試誤差較小，模型可用來(lái)分析與預(yù)測(cè)異綠原酸B的提取率，得出最佳超聲功率300w、最佳提取時(shí)間51min、最佳料液比為38：1（g/mL）、最佳乙醇濃度為74%。

2.2 ?交互作用分析

異綠原酸B的交互影響見(jiàn)如圖1。由圖1的3D圖可知響應(yīng)面曲面的傾斜程度確定兩者對(duì)響應(yīng)面值的影響程度，說(shuō)明兩者之間的交互作用，AC（功率與料液比）的曲面傾斜的坡度最抖，表示功率與料液比的交互作用最顯著;而圖AB（提取時(shí)間與濃度）的曲面傾斜的坡度最緩，則提取時(shí)間與濃度的交互作用影響較小。

3 ?結(jié)論

本試驗(yàn)是建立在前期超聲提取臭靈丹草中異綠原酸B單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)后，選擇四因素中的三水平進(jìn)行解析，根據(jù) Box-Behnken設(shè)計(jì)，提取出異綠原酸B的成分，通過(guò)數(shù)據(jù)分析可知，異綠原酸B最佳提取條件為：最佳超聲功率300w、最佳提取時(shí)間51min、最佳料液比為38：1（g/mL）、最佳乙醇濃度為74%;在所選因素范圍內(nèi)提取影響順序?yàn)椋禾崛∫掖紳舛?料液比 >提取功率>提取時(shí)間。該試驗(yàn)可為臭靈丹草中的異綠原酸B提取工藝進(jìn)行優(yōu)化提供參考，也對(duì)該中藥的二次開(kāi)發(fā)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王胤驍.云南民間常用藥臭靈丹的研究概述[J].云南中醫(yī)中藥 ? ? ? 雜志，2019（07）.

[2] 韓永成.金銀花藥材質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)研究[J].中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)位 ? ? ?論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)，2014（01）.

[3] 朱雪飛.固態(tài)發(fā)酵法制備苜蓿肽的工藝及其理化特性研究[J]. ? ? ?中國(guó)優(yōu)秀碩士學(xué)士論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)，2015（05）.

（編輯：赫亮）