大鼠Klotho蛋白水平隨血壓升高而降低

王彥琛，楊偉，張瑋，羅丹，蘇顯明

1.咸陽(yáng)市中心醫(yī)院 老年病科，陜西 咸陽(yáng) 712000；

2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 老年心血管內(nèi)科，陜西 西安 710061

高血壓是一種發(fā)病率高、可導(dǎo)致全身組織器官產(chǎn)生多種嚴(yán)重并發(fā)癥的慢性疾病，不僅給患者自身帶來(lái)病痛，而且給患者及家庭也帶來(lái)嚴(yán)重的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已成為全球健康問(wèn)題[1-2]。目前高血壓的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡述清楚。研究發(fā)現(xiàn)，Klotho（kl）蛋白能夠修復(fù)受損內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)內(nèi)皮釋放含一氧化氮（NO）的體液途徑來(lái)保護(hù)心血管系統(tǒng)免受損傷，推測(cè)與高血壓發(fā)生有一定的關(guān)系[3-4]。我們?cè)诮⒏哐獕捍笫竽Ｐ秃?，檢測(cè)了血漿中kl蛋白和NO水平隨血壓水平變化的規(guī)律，以明確kl蛋白與高血壓發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

7周齡雄性SD大鼠（體質(zhì)量200±10 g）由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為高血壓組和對(duì)照組，每組24只。造模組給予N'-硝基-L-精氨酸98 mg/d連續(xù)灌胃[5]，對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃1/d，共28 d。

大鼠腎小管上皮細(xì)胞、大鼠腎小管上皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基購(gòu)于普諾賽公司；N'-硝基-L-精氨酸購(gòu)于凡科維公司；PBS購(gòu)于上海雙螺旋生物科技有限公司；kl蛋白、血栓素（TXA2）、內(nèi)皮素（ET）酶聯(lián)免疫法、NO一步法、丙二醛（MDA）TAB法、超氧化物歧化酶（SOD）WST-1法試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；倒置相差顯微鏡為OLYMPUS公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀購(gòu)于上海賽默飛世爾科技有限公司；BP-300A全自動(dòng)大小鼠無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量系統(tǒng)購(gòu)于成都秦盟軟件有限公司。

1.2 樣本采集與處理

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前先分別用 0、100、200 μmol/L 的N'-硝基-L-精氨酸干預(yù)大鼠腎小管上皮細(xì)胞，24 h后Real-time PCR檢測(cè)kl基因的表達(dá)變化。

分別于造模成功停藥后第 7、14、21、28 d稱重，測(cè)安靜狀態(tài)下大鼠尾動(dòng)脈血壓3次，取平均值，每組抽取6只體質(zhì)量相近的大鼠，用10%水合氯醛按0.35 mL/100 g麻醉，取腹主動(dòng)脈血EDTA抗凝，離心血漿，-20℃保存，用于檢測(cè)kl蛋白、TXA2、ET、MDA、NO含量及SOD活力。采血后立即處死大鼠，快速取出胸主動(dòng)脈，生理鹽水沖洗，10%甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，分別用于HE染色、免疫組化CD31標(biāo)記。

1.3 PCR檢測(cè)kl基因的表達(dá)

將腎小管上皮細(xì)胞傳代、計(jì)數(shù)、凍存，細(xì)胞生長(zhǎng)至密度80%左右進(jìn)行加藥處理，各組加入N'-硝基-L-精氨酸的濃度為 0、100、200 μmol/L，培養(yǎng)24 h后提供細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。檢測(cè)所需的kl及β-actin引物從萬(wàn)科生物科技公司訂購(gòu)，引物序列見(jiàn)表1。

1.4 血漿kl蛋白、TXA2、ET含量測(cè)定

采用ELISA試劑盒，酶標(biāo)儀測(cè)定D450nm值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度及濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

1.5 血漿NO、MDA含量及SOD活力測(cè)定

分別采用試劑盒測(cè)定血漿NO、MDA含量及SOD活力。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用t檢驗(yàn)比較2組大鼠實(shí)驗(yàn)初始的收縮壓。采用析因設(shè)計(jì)方差分析干預(yù)后2組大鼠收縮壓的變化。采用兩因素多水平析因設(shè)計(jì)對(duì)2組大鼠的kl蛋白濃度，NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力進(jìn)行分析整理。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型的建立

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用不同濃度的N'-硝基-L-精氨酸干預(yù)大鼠腎小管上皮細(xì)胞，Real-time PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示N'-硝基-L-精氨酸影響kl基因的表達(dá)，因此在干預(yù)藥物停藥1周后測(cè)定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，避免造模藥物影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性經(jīng)擴(kuò)增曲線及熔解曲線確定（圖1），用2-△△Ct法計(jì)算mRNA表達(dá)水平（圖2）。

表1 引物及序列

表2 2組大鼠用藥前收縮壓比較（n=48）

圖1 kl基因（A）和β-actin（C）的熔解曲線及kl基因（B）和β-actin（D）的擴(kuò)增曲線

2.2 血壓水平結(jié)果

實(shí)驗(yàn)初始分別檢測(cè)48只大鼠的收縮壓，2組大鼠的收縮壓差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.820，P=0.417）（表2）。經(jīng)藥物干預(yù)后，分別在停藥后的第7、14、21、28 d測(cè)量2組大鼠的收縮壓，結(jié)果見(jiàn)表3。采用析因設(shè)計(jì)方差分析2組大鼠的收縮壓（表4）。在α=0.05水準(zhǔn)上，校正模型檢驗(yàn)F=171.841，P=0.000，模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在是否用藥與時(shí)間的交互作用統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果中，F(xiàn)=19.706，P=0.00，需要進(jìn)一步闡釋。在分析是否用藥的單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果中，F(xiàn)=1126.251，P=0.000，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即高血壓組的收縮壓與對(duì)照組的收縮壓的影響有顯著性差異，且高血壓組的收縮壓明顯高于對(duì)照組。進(jìn)一步分析7、12、21、28 d的收縮壓變化情況，結(jié)果表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.064，P=0.000），而且隨著時(shí)間的推移，血壓不斷升高。

2.3 各組 kl蛋白、NO、TXA2、ET、MDA 含量及SOD活性的變化

采用N'-硝基-L-精氨酸誘導(dǎo)大鼠高血壓實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀樵u(píng)估實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行?，?shí)驗(yàn)中引入TXA2、ET、MDA含量及SOD活力檢測(cè)。

對(duì)2組大鼠的kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力進(jìn)行分析、整理。通過(guò)血壓、干預(yù)后持續(xù)時(shí)間2個(gè)因素進(jìn)行多水平析因設(shè)計(jì)，血壓分對(duì)照組、高血壓組2個(gè)水平，干預(yù)后持續(xù)時(shí)間分為7、14、21、28 d共4個(gè)水平，采用兩因素多水平析因設(shè)計(jì)，共8種組合，每組6例，共48例。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力情況分別見(jiàn)表5、圖3、圖4。

圖2 不同濃度N'-硝基-L-精氨酸干預(yù)大鼠腎小管上皮細(xì)胞kl表達(dá)情況

表3 2組大鼠用藥后收縮壓變化情況

表4 2組大鼠用藥后收縮壓變化的方差分析結(jié)果

圖3 2組大鼠ET、TXA2、MDA含量及SOD活力隨時(shí)間變化趨勢(shì)

表5 2組大鼠用藥后kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力情況描述

從析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果（表6）可以看到，在α=0.05水準(zhǔn)上，kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力的P值均＜0.05，說(shuō)明模型均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血壓、時(shí)間之間的交互作用對(duì)kl蛋白、NO、ET、MDA含量及SOD活力的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05），但對(duì)TXA2含量的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。就血壓的單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果來(lái)看，單獨(dú)血壓對(duì)NO、ET、TXA2、MDA含量的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05），對(duì)kl蛋白濃度、SOD 活力的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。就時(shí)間的單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果來(lái)看，單獨(dú)時(shí)間對(duì)NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05），對(duì)kl蛋白濃度的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 2組大鼠kl蛋白、NO隨時(shí)間變化趨勢(shì)

表6 2組大鼠用藥后kl蛋白、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力析因設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果

2.4 血壓變化與主動(dòng)脈壁HE染色及CD31標(biāo)記

HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈管壁隨時(shí)間變化，細(xì)胞核的大小、排列、管壁厚度未見(jiàn)明顯的病理改變；高血壓組大鼠隨著高血壓的發(fā)生，主動(dòng)脈壁彈力纖維增生、排列紊亂，細(xì)胞核逐漸增大變形，中膜逐漸增厚（圖5）。

CD31標(biāo)記顯示，對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞隨時(shí)間無(wú)明顯變化，邊緣連續(xù)、光整，各時(shí)期無(wú)顯著差別；模型組大鼠隨著高血壓的發(fā)生，內(nèi)皮細(xì)胞受損，逐漸減少、脫落，部分完全缺失（圖6）。

3 討論

kl基因是Kuro等在1997年研究自發(fā)型高血壓時(shí)發(fā)現(xiàn)的與衰老有關(guān)的新基因[6]。研究發(fā)現(xiàn)，人和大鼠的kl基因有83%的同源性，主要在腎臟和腦表達(dá)。該基因敲除鼠出生后4周齡左右出現(xiàn)動(dòng)脈硬化和異位鈣化，并隨增齡而加重[7]。將kl雜合子鼠和野生型鼠同時(shí)放在高壓環(huán)境下20 h后，雜合子鼠主動(dòng)脈對(duì)乙酞膽堿松弛反應(yīng)的有效劑量增高，小動(dòng)脈對(duì)乙酞膽堿所引起的舒血管反應(yīng)明顯減弱[3]，推斷kl蛋白能夠通過(guò)內(nèi)皮釋放NO產(chǎn)物的體液途徑來(lái)保護(hù)心血管系統(tǒng)免受損傷。另有研究發(fā)現(xiàn)，kl蛋白可以減少過(guò)氧化氫所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和衰老，并增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性，降低 caspase-3、caspase-9 的活性[8]。缺乏 kl基因的小鼠，其骨髓、外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）數(shù)量明顯下降，而EPC的生理作用是當(dāng)血管受損時(shí)可以遷移、黏附到受損部位，通過(guò)增殖、分化作用為內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)受損的血管，因此考慮kl可能與EPC相互作用，參與血管損傷修復(fù)[9]。本課題組既往臨床研究[10]了高血壓組與非高血壓組人群的kl蛋白與NO水平，發(fā)現(xiàn)高血壓患者血清中kl蛋白隨NO的增加而增加，kl蛋白與NO之間存在正相關(guān)，推斷kl蛋白的降低可引起NO減少，而NO減少使NO/NOS系統(tǒng)功能低下，造成血管收縮、舒張不平衡，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，最終導(dǎo)致高血壓的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察非高血壓和高血壓大鼠生長(zhǎng)發(fā)育及疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中kl蛋白、NO的變化，進(jìn)一步推測(cè)kl與NO之間的關(guān)系。通過(guò)上述數(shù)據(jù)的分析（表6），我們可以觀察到，僅血壓的單獨(dú)效應(yīng)或者僅時(shí)間的單獨(dú)效應(yīng)對(duì)kl蛋白的影響無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但血壓及時(shí)間交互作用后對(duì)kl蛋白的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明kl的表達(dá)變化在高血壓發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中有時(shí)間累積效應(yīng)，而非受短期血壓波動(dòng)影響。我們發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、血壓的逐漸升高，kl蛋白發(fā)生了規(guī)律性變化：kl總體呈逐漸下降趨勢(shì)，但7～21 d高血壓組大鼠kl蛋白水平明顯高于對(duì)照組大鼠，21～28 d高血壓大鼠kl蛋白水平低于對(duì)照組。高血壓早期的病理生理變化是血管內(nèi)皮損傷，而既往研究顯示，kl蛋白在一定條件下可以與機(jī)體內(nèi)的多種血管活性物質(zhì)發(fā)生作用，使血管的舒張作用加強(qiáng)，抑制動(dòng)脈硬化的發(fā)生，最終達(dá)到對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[11-12]。且該蛋白可以與VEGFR-2受體發(fā)生作用，保持內(nèi)皮細(xì)胞的完整性[7]。因此推測(cè)在高血壓初期，kl蛋白可能因?yàn)檠獕荷摺⒎答伇磉_(dá)增加，發(fā)揮其保護(hù)血管內(nèi)皮、降低血壓的作用；而隨著血壓的穩(wěn)定高水平，kl蛋白濃度顯著降低，低于對(duì)照組水平，說(shuō)明長(zhǎng)期高血壓可影響kl蛋白合成。因kl蛋白主要表達(dá)于腎臟遠(yuǎn)曲小管及脈絡(luò)膜[13]，遠(yuǎn)曲小管是離子轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌的重要場(chǎng)所，其功能受醛固酮和抗利尿激素的調(diào)節(jié)，有研究發(fā)現(xiàn)RASS系統(tǒng)中血管緊張素Ⅱ可抑制kl mRNA表達(dá)，故在RASS系統(tǒng)對(duì)腎臟kl表達(dá)調(diào)節(jié)中，Ang應(yīng)發(fā)揮著主導(dǎo)作用，因此高血壓發(fā)生時(shí)，RASS系統(tǒng)激活，抑制kl基因的表達(dá)，kl蛋白最終減低，支持我們所觀察到的kl蛋白表達(dá)水平變化趨勢(shì)。

從上述數(shù)據(jù)可以看出，NO在血壓、時(shí)間及其2組之間交互影響時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們發(fā)現(xiàn)2組大鼠的NO也存在顯著差異：NO水平隨血壓升高及時(shí)間延長(zhǎng)總體趨勢(shì)逐漸降低，與血壓呈負(fù)相關(guān)；但7～14 d高血壓組大鼠NO水平明顯高于對(duì)照組大鼠，14～28 d高血壓組大鼠NO水平低于對(duì)照組（圖4）。已知內(nèi)皮細(xì)胞是血管中NO的主要來(lái)源，內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)合成和分泌的NO來(lái)參與調(diào)節(jié)血管張力、血壓和血管重塑等生理作用。高血壓早期內(nèi)皮細(xì)胞受損，NO產(chǎn)生減少。但是我們觀察到在高血壓發(fā)生的7～14 d NO水平高于對(duì)照組，與kl蛋白的波動(dòng)趨勢(shì)一致，結(jié)合上述kl蛋白升高的原因，我們考慮kl蛋白通過(guò)影響內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)影響體內(nèi)NO的含量，共同調(diào)節(jié)血壓水平。

另有研究表示[14]，kl基因缺陷的小鼠在出生4周后即可出現(xiàn)動(dòng)脈硬化，并隨增齡而加重，表現(xiàn)為主動(dòng)脈嚴(yán)重鈣化，肌性中動(dòng)脈中層鈣化、內(nèi)膜增厚，腎臟小動(dòng)脈嚴(yán)重鈣化等，這些血管變化與人類(lèi)動(dòng)脈硬化非常相似。把外源性正常kl cDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)給kl基因缺陷小鼠后，其動(dòng)脈硬化程度可顯著改善。本實(shí)驗(yàn)的病理切片也發(fā)現(xiàn)，隨著高血壓的發(fā)生，出現(xiàn)了血管管壁彈力纖維增厚、排列紊亂，彈力纖維板層結(jié)構(gòu)破壞；免疫組化CD31標(biāo)記明確顯示內(nèi)皮細(xì)胞不連續(xù)，逐漸變薄、缺失等內(nèi)皮損傷改變，且在28 d時(shí)內(nèi)皮缺失，這與我們觀察到的21～28 d時(shí)kl蛋白及NO顯著降低一致。

以上研究結(jié)果說(shuō)明，在高血壓發(fā)生發(fā)展中，RASS系統(tǒng)激活，kl基因表達(dá)減低，伴隨kl蛋白減少，血管內(nèi)皮受損、動(dòng)脈硬化加重，NO進(jìn)一步產(chǎn)生減少，血管收縮舒張功能失調(diào)，氧化應(yīng)激加強(qiáng)，最終導(dǎo)致血壓進(jìn)一步升高。提示kl蛋白可能通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)NO的途徑參與血壓調(diào)節(jié)過(guò)程，參與高血壓的發(fā)生發(fā)展。