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    GP73參與肝癌索拉菲尼獲得性耐藥的初步研究

    2020-11-16 03:26:48楊歡彭雨蒙李輝龍韋猛陳智煒唐置鴻孟維達韋滔魏從文鐘輝吳飛翔
    生物技術(shù)通訊 2020年4期
    關(guān)鍵詞:拉菲獲得性細胞株

    楊歡,彭雨蒙,李輝龍,韋猛,陳智煒,唐置鴻,孟維達,韋滔,魏從文,鐘輝,吳飛翔,3,4

    1.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院 肝膽外科,廣西 南寧 5300021;2.軍事醫(yī)學研究院 生物工程研究所,北京 100850;3.廣西肝癌診療工程技術(shù)研究中心,廣西 南寧 530021;4.區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室,廣西 南寧 530021

    原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常見的惡性腫瘤之一,每年新發(fā)病例和死亡病例均超過80萬例[1-2]。目前,中晚期肝癌患者以局部治療、系統(tǒng)治療等為主[3]。目前各種常見治療手段都有局限性,所以現(xiàn)在肝癌治療領(lǐng)域的共識是多學科協(xié)作和多種治療方法聯(lián)用的綜合治療[4]。綜合治療方法包括介入治療、消融治療、靶向治療、免疫治療和放化療等,由于分子靶向治療的選擇性、靈敏性和效率都很高,靶向治療以成為傳統(tǒng)肝癌治療手段之外極其重要的治療方法[5]。作為第一個被美國FDA批準用于治療肝癌的分子靶向治療藥物,索拉菲尼是肝癌系統(tǒng)性治療中惟一能夠改善患者存活率、顯著延長晚期患者總體生存時間的化療藥物。

    索拉菲尼是一種新型多靶點抗腫瘤藥物,通過與細胞內(nèi)ATP結(jié)合位點上的三磷酸腺苷競爭性結(jié)合,阻斷酪氨酸激酶和絲/蘇氨酸激酶的活性。大量臨床研究表明,絕大部分HCC患者通過一段時間的索拉菲尼藥物治療后,表現(xiàn)出明顯的藥物耐受特征,導致索拉菲尼對HCC的療效欠佳。多種機制與索拉菲尼的獲得性耐藥相關(guān),有報道顯示腫瘤細胞SIRT1、EGFR或其配體等分子的過表達,PI3K/Akt、JAK/STAT3信號通路的異常激活,以及Ras/Raf/MEK/ERK通路的活性下調(diào)均降低HCC對索拉菲尼的敏感性[6-7]。

    高爾基蛋白73(Golgi protein 73,GP73)又名GOLM1(Golgimembraneprotein1)或 GOLPH2(Golgi phosphorprotein 2),是2000年發(fā)現(xiàn)的一種高爾基膜蛋白,在正常肝臟的膽管上皮細胞中穩(wěn)定表達[8]。70%以上的肝癌病人,GP73蛋白在血清及肝組織中的表達水平均顯著上調(diào)。最近的研究已證實GP73在肝癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的重要作用,張宏冰等研究發(fā)現(xiàn)mTORC1能夠通過調(diào)節(jié)GP73促進肝癌的發(fā)生發(fā)展[9]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)高表達的GP73抑制了由饑餓誘導的細胞自噬的激活,而GP73敲除細胞的自噬水平明顯升高。自噬在肝癌索拉菲尼的原發(fā)性耐藥中具有雙向作用。mTOR抑制劑雷帕霉素(rapamycin)并不能完全恢復(fù)耐藥細胞株對索拉菲尼的敏感性。這就提示我們,在索拉菲尼獲得性耐藥的HCC細胞中還有別的機制參與自噬的負調(diào)控。因此,研究GP73與索拉菲尼獲得性耐藥的關(guān)系對原發(fā)性肝癌的分子靶向治療具有重要意義。

    在本研究中,我們探討了GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細胞株中的表達情況,以及GP73對索拉菲尼耐藥性的影響,為GP73參與肝癌索拉菲尼獲得性耐藥的分子機制研究提供實驗基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    肝癌細胞HepG2(本實驗室保存);DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司);索拉菲尼(Sigma-Aldrih公司);轉(zhuǎn)染試劑VigoFect(Qbiogene公司);MTT檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司);Flag-GP73、Flag-Vector(本實驗室構(gòu)建);si-GP73、si-scramble(吉瑪基因公司);anti-GP73抗體、anti-Tubulin抗體(Abcam公司)。

    1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

    HepG2細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),構(gòu)建耐藥細胞株時,在培養(yǎng)基中加入不同濃度的索拉菲尼。細胞轉(zhuǎn)染前1 h更換一半新鮮的DMEM培養(yǎng)基,按說明書要求配制小干擾RNA(siRNA)和轉(zhuǎn)染試劑混合液,滴加入細胞,常規(guī)培養(yǎng),4~6 h后補充另一半培養(yǎng)基。

    1.3 MTT法檢測細胞存活率

    細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板,每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的D490nm值,計算細胞存活率。

    1.4 蛋白免疫印跡實驗

    收集細胞,1×PBS沖洗3次,3000 r/min離心3 min后棄上清。加入適量1×PBS重懸細胞,加入等量4×SDS緩沖液[10%甘油,2%十二烷基苯磺酸鈉,50 mmol/L Tris-HCl(pH6.8),2.5% β巰基乙醇,0.1%溴酚藍],沸水浴15 min,12 000 r/min低溫離心10 min,取上清進行SDS-PAGE,半干轉(zhuǎn)到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶液室溫封閉1 h,一抗和二抗分別室溫孵育1 h,TBST洗3次,每次5 min,將Perkin Elmer的ECL發(fā)光液均勻涂在PVDF膜上,暗室顯影。

    1.5 數(shù)據(jù)分析處理

    采用Graphpad prism 8.0進行統(tǒng)計學分析;計量資料采用x±s表示,組間比較采用雙因素方差分析;P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 HepG2細胞索拉菲尼耐藥株的構(gòu)建

    在HepG2細胞培養(yǎng)基中加入索拉菲尼,使其終濃度為0.5 μmol/L,連續(xù)作用1周;換成新鮮培養(yǎng)基,鏡下觀察細胞正常生長后,增加0.25 μmol/L溶液繼續(xù)培養(yǎng)1周。如此反復(fù)換液、傳代,逐步提高索拉菲尼濃度(0.5~5 μmol/L)間歇誘導,最終獲得HepG2細胞的索拉菲尼耐藥株(HepG2-SR)。為了驗證構(gòu)建的索拉菲尼耐藥細胞株對索拉菲尼的敏感性降低,在野生型HepG2細胞及索拉菲尼獲得性耐藥細胞株中加入不同濃度的索拉菲尼,MTT法檢測細胞的存活率。結(jié)果顯示,培養(yǎng)基中索拉菲尼濃度越高,細胞存活率越低;索拉菲尼耐藥細胞株對索拉菲尼的敏感性比野生型細胞大幅降低(P<0.05)(圖1)。HepG2索拉菲尼耐藥細胞株建立成功。

    2.2 GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細胞株中的表達明顯升高

    收集野生型HepG2細胞和HepG2索拉菲尼耐藥株細胞,分別加入等量的PBS和4×SDS緩沖液重懸,沸水浴15 min使細胞充分裂解。12 000 r/min低溫離心10 min,取等量上清進行SDSPAGE。半干轉(zhuǎn)到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶液室溫封閉 1 h,anti-GP73抗體(1∶1000 TBST溶解)、anti-Tubulin抗體(1∶5000 TBST溶解)室溫搖床孵育1 h,用5%脫脂奶粉以1∶2000的比例稀釋羊抗鼠HRP-conjugated二抗,室溫搖床孵育1 h,TBST洗3次,以1∶1的比例配制ECL發(fā)光液顯影。結(jié)果顯示,GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細胞株中的表達比野生型細胞株高(圖2)。

    2.3 過表達GP73的HepG2細胞對索拉菲尼敏感性降低

    GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細胞株中高表達,接下來將GP73在野生型HepG2細胞中高表達,研究GP73在肝癌細胞中對索拉菲尼敏感性的影響。在野生型HepG2細胞中轉(zhuǎn)染Flag-GP73,對照組轉(zhuǎn)染等量Flag-Vector,24 h后加入不同濃度的索拉菲尼(0、5、10、15、20 μmol/L)處理細胞,48 h后收取細胞,MTT法檢測細胞存活。結(jié)果表明,隨著索拉菲尼的濃度升高,細胞存活率明顯越低;而過表達GP73的HepG2細胞(Flag-GP73)對索拉菲尼的敏感性較對照組(Flag-Vector)降低(P<0.05)(圖 3)。

    2.4 耐藥細胞株敲低GP73能夠升高索拉菲尼的敏感性

    GP73過表達后細胞對索拉菲尼的敏感性降低,接下來探討在肝癌索拉菲尼耐藥細胞株中敲低GP73后對索拉菲尼敏感性的影響。在已構(gòu)建的索拉菲尼耐藥細胞株中轉(zhuǎn)染si-GP73敲低細胞中的GP73水平,對照組轉(zhuǎn)染等量的si-scramble。24 h后加入不同濃度的索拉菲尼(0、5、10、15、20 μmol/L)處理細胞,48 h后收取細胞,MTT法檢測細胞存活。結(jié)果表明,隨著索拉菲尼的濃度升高,細胞存活率明顯越低;而在索拉菲尼耐藥細胞中敲低GP73后,耐藥細胞株(si-GP73)對索拉菲尼的敏感性高于對照組(si-scramble)(P<0.05)(圖4),表明耐藥細胞株敲低GP73能夠升高索拉菲尼的敏感性。

    3 討論

    圖1 索拉菲尼耐藥細胞株對索拉非尼的敏感性降低

    圖2 GP73在肝癌索拉菲尼耐藥細胞株中高表達

    原發(fā)性肝細胞癌作為發(fā)病率和病死率極高的癌癥之一,一直都是科研人員及臨床工作者努力攻克的難題。肝癌具有生長速度快、惡性程度高、易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及藥物耐受等特點,因此肝癌患者的預(yù)后較差[10]。索拉菲尼作為多靶點的分子藥物,在肝癌治療中能夠改善患者存活率,但其療效仍然有限,耐藥性的產(chǎn)生可能是導致其化療失敗的主要原因[11]。因此,研究肝細胞癌的耐藥機制,對于提高其化療療效,指導臨床用藥有著重要的價值。

    GP73不僅可以作為肝癌的腫瘤標志物,也參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過程[12]。我們研究發(fā)現(xiàn),在索拉菲尼獲得性耐藥的肝癌細胞株中,位于高爾基體的糖蛋白GP73的表達水平顯著升高。此外,GP73過表達細胞對索拉菲尼的敏感性降低,GP73敲低恢復(fù)了耐藥細胞對索拉菲尼的敏感性。因此,GP73很可能參與到原發(fā)性肝癌索拉菲尼耐藥的機制當中。

    圖3 GP73過表達細胞對索拉菲尼的敏感性降低

    圖4 敲低GP73能升高索拉菲尼耐藥細胞株對索拉菲尼的敏感性

    此前有研究發(fā)現(xiàn)自噬與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[13]。Shimizu等發(fā)現(xiàn),索拉菲尼可以激活HCC細胞的自噬,誘導自噬小體的形成,增強自噬的活性;而將自噬抑制劑與索拉菲尼聯(lián)用后,細胞凋亡增多,生存力下降,腫瘤生長受到明顯抑制。然而,Bareford等用索拉菲尼與自噬誘導劑培美曲塞聯(lián)合加入HCC細胞,發(fā)現(xiàn)培美曲塞與索拉菲尼可起協(xié)同作用[14]??梢姡允稍诟伟┧骼颇岬脑l(fā)性耐藥中具有雙向作用。早前我們實驗室發(fā)現(xiàn)高表達的GP73抑制了由饑餓誘導的細胞自噬的激活,而GP73敲除細胞的自噬水平明顯升高。因而,GP73很可能通過負調(diào)控自噬,進而影響肝癌索拉菲尼獲得性耐藥。

    綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)GP73在肝癌索拉菲尼獲得性耐藥的過程中有重要作用,為深入研究索拉菲尼耐藥的分子機制奠定了實驗基礎(chǔ)。

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