慢病毒介導的靶向c-Met可誘導shRNA穩(wěn)定乳腺癌MDA-MB-231細胞系的構建及生物活性鑒定

王金西，郭曉娟，程錦紅，張紹東，焦保庭，檀曉東

1.邯鄲市第一醫(yī)院 普外四科，河北 邯鄲 056002；2.邯鄲市中心醫(yī)院 病理科，河北 邯鄲 056001

慢病毒表達載體轉染效率較高，其目的基因可與宿主細胞基因組整合，且能夠長期表達。倘若某些腫瘤細胞的表型基因完全被敲除，最終會導致腫瘤死亡，必然影響后續(xù)實驗的進行?？烧T導shRNA是建立在四環(huán)素操縱子系統(tǒng)基礎上的shRNA可誘導系統(tǒng)，在這個系統(tǒng)中，四環(huán)素操縱子（TetO）序列能夠與四環(huán)素阻遏蛋白（TetR）結合，并能取代polⅢ啟動子中的非必需序列。四環(huán)素阻遏蛋白可以使含有四環(huán)素操縱子的啟動子阻止 siRNA 的轉錄。四環(huán)素（tetracycline，Tet）或多西環(huán)素（doxycycline，DOX）與四環(huán)素阻遏蛋白結合，可以改變四環(huán)素阻遏蛋白的三級結構，導致四環(huán)素操縱子序列上的四環(huán)素阻遏蛋白脫落，從而使shRNA轉錄表達[8]。本研究通過構建針對c-Met基因的shRNA慢病毒載體，擬建立可調控表達shRNA的乳腺癌細胞MDA-MB-231，為后續(xù)實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌MDA-MB-231細胞株購于上海生命科學院細胞庫，于含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%的胰酶消化傳代；大腸桿菌HB101、Top10感受態(tài)細胞購于北京鼎國生物技術公司；TA載體、pSD400質粒、pMDL質粒、pRSV質粒、pMDG質粒由北京大學醫(yī)學部藥學院饋贈；Megatran1.0購于ORIGEN公司；DNA提取試劑盒購于Axygen公司；BamHⅠ FastDigest酶、EcoRⅠ FastDigest酶購于Fermentas公司；胎牛血清購于Hyclone公司；RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、0.25%胰酶（Trypsin-EDTA）、嘌呤霉素購于邁晨科技有限公司；鼠抗人c-Met單抗購于CalBiochem公司；兔抗人GAPDH單抗購于Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG和HRP標記的羊抗兔IgG購于Santa Cruz公司。

1.2 shRNA序列的設計

登入GenBank尋找c-Met mRNA序列，在Ambion公司網(wǎng)址（https://www.Genscript.Com/ss-lbin/app/rnai）尋找人c-Met的RNA干擾靶點序列并設計對應的單鏈核苷酸序列。根據(jù)靶點序列及shRNA設計策略（BamHⅠ酶切位點+正義鏈+Loop+反義鏈+終止信號+HindⅢ酶切位點），設計4對shRNA序列（3對干擾序列及1對隨機對照序列）。引物 1，c-Met-Up-primer：5'-TGGATCCAA GGTCGGGCAGGAAGAG-3'；c-Met-Down-primer 1：5'-AGGATCCAAAAAAGAATGTCATTCTACATG AGCCTCTTGAGCTCATGTAGAATGGACATTCTGGT GTTTCGTCCTTTCCAC-3'。引物2，c-Met-Up-primer：5'-TGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAG-3'，c-Met-Down-primer 2：5'-AGGATCCAAAAAATCAGAACCA GAGGCTTGGTCCTCTTGAGACCAAGCCTCTGGTTCTG ATGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3'。引物3，c-Met Upprimer：5'-TGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAG-3'，c-Met Down-primer 3：5'-AGGATCCAAAAACATGG CTCTAGTTGTCGACGAGTACTGGTCGACAACTAGAGC CATGGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3'。 引 物 4，Scramble Up-primer：5'-TGGATCCAAGGTCGGGCAG GAAGAG-3'，Scramble Down-primer：5'-AGGATCCA AAAACAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTG GTGCTCTTCATCTTGTTGGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3'。經(jīng)Blast基因同源性分析，此序列不與人類任何基因序列同源。

1.3 TA-c-Met-shRNA質粒的構建及鑒定

將合成的成對寡核苷酸引物用滅菌去離子水溶解并稀釋，建立PCR體系（反應條件：94℃2 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環(huán)；72℃ 10 min）。PCR結束后將反應體系進行瓊脂糖凝膠電泳，獲取目標c-Met-shRNA雙鏈寡核苷酸。用TA-DNA連接酶將雙鏈寡核苷酸與TA載體定向連接后轉化感受態(tài)大腸桿菌Top10細胞，在含氨芐青霉素的瓊脂糖平板上培養(yǎng)，挑選抗氨芐青霉素的菌落并擴增培養(yǎng)，裂解菌落并提取質粒，提取的質粒經(jīng)BamHⅠ酶切，瓊脂糖電泳鑒定目的片段與載體質粒。連接成功的質粒送華大基因公司測序。

1.4 TA-c-Met-shRNA質粒瞬時轉染乳腺癌MDA-MB-231細胞后檢測c-Met表達變化

采用陽離子脂質體（Megatran1.0）轉染法。轉染前1 d將細胞接種于六孔板中，設置3個接種復孔。細胞濃度為4×105/mL，每孔2 mL新鮮培養(yǎng)液，待細胞增至約80%時，將構建的4個重組質粒分別轉染MDA-MB-231細胞，37℃、5% CO2孵箱中孵育8～10 h，更換新鮮的含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，同時設置空白對照。72 h后提取細胞蛋白質，BCA法測定蛋白濃度。取蛋白樣品30 μg進行Western印跡，檢測c-Met蛋白的表達。經(jīng)9% SDS-PAGE分離后轉移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBS緩沖液常溫封閉1 h，洗膜后分別加入兔抗人c-Met多克隆抗體1∶500、GAPDH抗體1∶3000，再分別用HRP標記的羊抗兔IgG堿性磷酸酶抗體（1∶3000）進行二抗雜交，最后加入化學發(fā)光試劑放射自顯影，成像儀拍照記錄。用ANOVNHolm-Sidak軟件分析各蛋白條帶的吸光度值。

1.5 pSD400-c-Met-shRNA質粒的構建及鑒定

將TA-c-Met-shRNA1用BamHⅠ酶切，得到含有BamHⅠ酶切位點的shRNA1線性片段。pSD400質粒亦經(jīng)BamHⅠ酶切，得到含有BamHⅠ酶切位點的線性片段，使其去磷酸化。將去磷酸化的線性pSD400質粒和從TA質粒中提取的c-Met-shRNA1 DNA片段用連接酶連接起來，形成pSD400-c-met-shRNA重組質粒，將其轉入感受態(tài)大腸桿菌HB101，用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)液進行篩選（pSD400質粒中含有抗氨芐青霉素的基因）。將篩選出的菌落進行PCR擴增，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證。將PCR驗證成功的菌落培養(yǎng)擴增，提取質粒。由于pSD400質粒中含有4個EcoRⅠ酶切位點，環(huán)狀質粒經(jīng)EcoRⅠ酶切后會出現(xiàn)4條大小不同的條帶。質粒經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ酶切驗證后送基因公司測序。

1.6 shRNA慢病毒包裝

取對數(shù)生長期的293T細胞用胰酶消化，用A液（不含丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，加入非必需氨基酸，不含雙抗）培養(yǎng)細胞，將細胞接種于六孔板，4×105/孔，于 37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用Megatran1.0將pSD400-c-Met-shRNA/pSD400-scramble-shRNA、pRSV、pMDL、VSVG等4種質粒共轉染293T細胞，6 h后培養(yǎng)基更換為B液（含丙酮酸鈉的DMEM培養(yǎng)基，3%胎牛血清，加入非必需氨基酸，不含雙抗）。分別收取48和72 h的病毒液。

1.7 顯微鏡下觀察確定嘌呤霉素篩選藥物濃度

經(jīng)不同濃度嘌呤霉素篩選7 d后，藥物濃度為0.8 μg/mL時即可殺死全部細胞，故最終確定嘌呤霉素篩選濃度為0.8 μg/mL。

1.8 慢病毒感染MDA-MB-231細胞

將病毒液加入提前鋪有MDA-MB-231細胞的六孔板里，3×105/孔（去掉原有的含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基），孵育24 h后加入終濃度為0.8 μg/mL的嘌呤霉素進行篩選。

自動尋路的關鍵是路徑規(guī)劃，分為全局路徑規(guī)劃和局部路徑規(guī)劃。本系統(tǒng)為了呈現(xiàn)整體樣板房的效果，故而采用全局路徑規(guī)劃。即根據(jù)設定的路徑信息，借助路徑搜索算法，利用不同目標結點提供給客戶不一樣的選擇，從而產(chǎn)生不盡相同的漫游路線，從而實現(xiàn)對這個系統(tǒng)的漫游。在Unity3D 中由NavMesh 組件完成尋路開發(fā)，其核心算法是用三角形代替?zhèn)鹘y(tǒng)網(wǎng)格，計算拐點優(yōu)化尋路路徑，算法實現(xiàn)過程如圖1 所示。

1.9 穩(wěn)定細胞系的驗證

用嘌呤霉素篩選7～10 d后，空白組MDAMB-231細胞全部死亡，而pSD400-c-Met-shRNAMDA-MB-231組和pSD400-scramble-MDA-MB-231組有多個單克隆細胞出現(xiàn)。單克隆細胞經(jīng)擴大培養(yǎng)達到一定數(shù)量后，提取細胞DNA基因組，用設計好的pSD400質粒的引物進行PCR擴增，以檢測pSD400片段。

1.10 篩選出最適多西環(huán)素誘導濃度

選擇對數(shù)增長期的pSD400-c-Met1-shRNAMDA-MB-231 細胞接種于六孔板，4×105/孔,分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL的多西環(huán)素進行誘導，72 h后提蛋白，Western印跡篩選最適多西環(huán)素濃度。

1.11 MTT法檢測適當敲除c-Met基因后對細胞增殖的影響

把pSD400-c-Met1-shRNA-MDA-MB-231、pSD400-scramble-MDA-MB-231、MDA-MB-231等3種細胞接種于六孔板，4×105/孔，加入 0.4 μg/mL多西環(huán)素進行誘導。將誘導3 d的細胞用0.25%胰酶消化后制成單細胞懸液，計數(shù)調整細胞濃度為 1.5×104/mL，將細胞接種于 96孔板，1500/孔，每板設6組，每組設5個復孔。為防止邊緣效應，周邊各孔加入200 μL PBS。細胞于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。設置6個檢測時間點，分別是12、24、48、72、96、120 h。 加 入 MTT（5 mg/mL）20 μL，避光孵育4 h后去除96孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，搖勻10 min。用酶標儀檢測各孔的D490nm值。

2 結果

2.1 TA-c-Met-shRNA載體的鑒定

將提取的4組質粒進行BamHⅠ酶切，電泳（圖1）得到2 kb左右和370 bp左右的2條帶，說明目的片段與TA載體質粒連接成功，命名為TA-c-Met-shRNA。測序證實連接的干擾序列與設計序列完全正確（序列略）。

2.2 TA-c-Met-shRNA質粒瞬時轉染乳腺癌MDA-MB-231細胞后c-Met蛋白表達的變化

轉染72 h后提取細胞總蛋白進行Western印跡，重復3次，相對于未轉染組，3個TA-c-MetshRNA組的c-Met蛋白表達均有所下降，TA-c-Met-shRNA1下降最顯著（P＜0.05），對照組則無明顯下降（圖2）。

2.3 pSD400-c-Met-shRNA質粒鑒定

提取的2組質粒經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切驗證后行凝膠電泳（圖3），BamHⅠ酶切后370 bp位置均出現(xiàn)了目的條帶，說明目的片段與pSD400載體質粒連接成功。EcoRⅠ酶切后出現(xiàn)4條大小不等的條帶，說明EcoRⅠ酶切成功，將質粒命名為pSD400-c-Met-shRNA/pSD400-scramble-shRNA。測序證實插入的干擾序列與設計序列完全正確。

圖1 TA-c-Met-shRNA載體BamHⅠ酶切電泳圖

圖2 Western印跡檢測shRNA沉默c-Met后的蛋白表達效率（*P＜0.05）

2.4 慢病毒感染MDA-MB-231細胞

慢病毒包裝成功后感染MDA-MB-231細胞，24 h后加入終濃度為0.8 μg/mL的嘌呤霉素篩選7 d，由于pSD400質粒中含有抗嘌呤霉素基因序列，當pSD400質粒被慢病毒整合到MDA-MB-231細胞基因組后，MDA-MB-231細胞就具有了耐嘌呤霉素的特性，pSD400-c-Met-shRNA細胞組有數(shù)個細胞單克隆形成（pSD400-c-Met-shRNAMDA-MB-231），pSD400-scramble組有細胞單克隆形成（pSD400-scramble-MDA-MB-231）；空白組MDA-MB-231細胞內無抗嘌呤霉素基因表達，在嘌呤霉素存在的條件下細胞全部死亡（圖4）。

2.5 穩(wěn)定細胞系的驗證

圖 3 pSD400-c-Met、pSD400-scramble-shRNA 載體BamHⅠ、EcoRⅠ酶切電泳圖

圖4 嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細胞系

圖5 PCR驗證穩(wěn)定細胞系內含有pSD400載體

圖6 Western印跡檢測不同濃度多西環(huán)素誘導pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細胞后的蛋白表達

分別以pSD400-c-Met1-shRNA-MDA-MB-231細胞 DNA、pSD400-scramble-shRNA-MDAMB-231細胞DNA、pSD400質粒、MDA-MB-231細胞DNA為模板，用pSD400質粒引物進行PCR擴增，pSD400質粒為陽性對照，MDA-MB-231細胞為陰性對照，結果以穩(wěn)定細胞株DNA、pSD400質粒為模板的PCR反應后同時擴增出了約500 bp的條帶，而MDA-MB-231細胞為模板的PCR反應中無條帶出現(xiàn)。說明穩(wěn)定細胞株DNA中含有pSD400質粒，MDA-MB-231細胞中本身不含有pSD400質粒（圖5）。

分別選擇 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 μg/mL的多西環(huán)素誘導pSD400-c-Met-shRNA-MDA-MB-231細胞株；用0.5 μg/mL多西環(huán)素誘導pSD400-c-Met-scramble-MDA-MB-231細胞株，Western印跡檢測c-Met蛋白表達。結果顯示pSD400-c-MetshRNA-MDA-MB-231細胞株在不同濃度多西環(huán)素誘導下c-Met蛋白表達量呈逐漸遞減趨勢，且在0.5 μg/mL濃度下c-Met蛋白表達量接近于0；pSD400-scramble-MDA-MB-231細胞株無論有、無多西環(huán)素誘導，c-Met表達量無明顯變化（圖6）。

2.6 適當敲除c-Met基因對MDA-MB-231細胞增殖的影響

將3種細胞株（pSD400-c-Met-shRNA-MDAMB-231、pSD400-scramble-MDA-MB-231、MDAMB-231）接種于 96孔板，加入 0.4 μg/mL 多西環(huán)素分別誘導12、24、48、72、96、120 h，在各時間點經(jīng)MTT法讀取D490nm值。pSD400-c-Met-shRNAMDA-MB-231細胞株加入多西環(huán)素誘導后，由于c-Met基因被適當敲除，在第3 d出現(xiàn)了細胞增殖的抑制，與不加多西環(huán)素組相比有明顯的統(tǒng)計學差異（P＜0.05），而 pSD400-scramble-MDA-MB-231、MDA-MB-231無論加或不加多西環(huán)素誘導，細胞增殖無明顯差異（P＞0.05）（圖7）。

3 討論

原癌基因c-Met位于人染色體7q21-31，編碼相對分子質量為190 000的跨膜糖蛋白。c-Met蛋白在多種上皮細胞，包括腫瘤細胞內廣泛存在，但不存在于間質細胞中[9]，其屬于受體酪氨酸蛋白激酶家族，是HGF的上皮特異性受體。HGF或SF由間質細胞產(chǎn)生并作為c-Met受體的配體，形成HGF/SF-c-Met內分泌信號傳導系統(tǒng)。配體的結合可使c-Met受體的酪氨酸激酶磷酸化，促使細胞的有絲分裂、細胞動力和向腺上皮的形態(tài)分化[10]。Jin等[11]研究顯示，乳腺癌c-Met蛋白表達的陽性率約為70%，與乳腺癌患者的臨床分期、淋巴結轉移、組織學分級顯著相關。在腫瘤細胞增殖、進展及轉移中，c-Met蛋白的異常表達扮演了重要角色。因此，c-Met可能作為乳腺癌治療的新靶點。近年來，人工設計的c-Met受體拮抗劑在實驗中證實能有效抑制腫瘤轉移[12-13]。馮煒紅等[14]研究顯示，c-Met抑制劑可抑制c-Met及AKT磷酸化，抑制腫瘤細胞增生，促進腫瘤細胞凋亡。

圖7 適當敲除c-Met對細胞增殖的影響

siRNA是21～23 bp的雙鏈RNA分子，可誘導哺乳動物細胞基因特異性沉默，這種RNA干擾可以通過體外合成的siRNA反式感染細胞來實現(xiàn)或者通過表達載體在體內表達siRNA，后者是一種可用于在細胞系中穩(wěn)定表達siRNA的方法。目前，大多數(shù)siRNA表達載體都是通過聚合酶Ⅲ啟動子U6和H1來驅動siRNA轉錄的。這些啟動子特別適合于shRNA的表達。然而，使用穩(wěn)定整合的siRNA特異性抑制基因表達不適合沉默與細胞生長或存活有關的基因。在這種情況下，調節(jié)siRNA在哺乳動物細胞中的表達就至關重要。有能力控制一個特定siRNA的表達時間和表達量，使得研究其對宿主的時間和濃度依賴性效應成為可能，并使細胞在siRNA啟動前和正常細胞一樣生長。此方法可用于研究宿主細胞對siRNA的存在和缺失的反應，往往有助于進一步了解靶基因的功能[16]。

本實驗通過化學合成單鏈RNA，經(jīng)過提純、雜交成雙鏈RNA，再根據(jù)RNA干擾原理構建了shRNA真核表達質粒，酶切電泳分析證實目的基因準確插入TA載體質粒，基因測序證實基因序列正確。將TA載體瞬時轉染乳腺癌細胞，72 h提取蛋白，Western印跡檢測的c-Met蛋白表達下降是一致的，而TA-c-Met-shRAN2、TA-c-MetshRAN3組下降不明顯，證實RNA干擾具有序列特異性。隨機對照序列組（TA-scramble-shRNA）及空白對照（MDA-MB-231細胞）未出現(xiàn)這種作用，說明TA載體及轉染試劑本身無RNA干擾效應。用BamHⅠ將攜帶目的基因的shRNA片段自TA載體切除、提純，并將該片段插入pSD400載體進行慢病毒包裝，感染MDA-MB-231細胞，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定細胞系，檢測證實穩(wěn)定細胞系內含有針對c-Met的shRNA片段。經(jīng)梯度濃度的多西環(huán)素誘導后，穩(wěn)定細胞系的c-Met表達量亦呈梯度變化。多西環(huán)素濃度為0.4 mg/mL時c-Met沉默率可達80%左右，此時細胞生長受到抑制，出現(xiàn)中等量細胞死亡。以上結果為下一步探討適當敲除c-Met基因后乳腺癌細胞對化療、放療敏感性檢測奠定了基礎。