聚乙烯亞胺修飾的熒光素鈉納米顆粒在熒光素眼底血管造影術(shù)的應(yīng)用和安全性△

楊倩 蔡雯婷 金惠子 余咚卉 沈天怡 于靖

近幾十年來，熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)常用于老年性黃斑變性[1]、糖尿病視網(wǎng)膜病變[2]和血管閉塞[3]等視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病的診斷。熒光素鈉是一種水溶性熒光染料，由于其制備工藝簡單、顯影效果好，已在膠質(zhì)瘤[4]、中樞神經(jīng)淋巴瘤[5]及眼底血管疾病等多種疾病的診斷中發(fā)揮重要作用。但是在臨床應(yīng)用中，由于熒光素鈉容易附著于細(xì)胞表面導(dǎo)致代謝緩慢，且易產(chǎn)生惡心、嘔吐甚至過敏等不良反應(yīng)，因此制備一種新型眼底血管造影劑格外重要。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine,PEI)是一種可修飾的高度支化聚合物，廣泛應(yīng)用于基因和藥物傳遞[6-11]、CT和MRI等多個領(lǐng)域[12-14]。在本研究中，我們制備了PEI修飾的熒光素鈉(PEI-NHAc-FS)納米顆粒(nanoparticles,NPs)用于FFA，既保留了熒光素鈉用于視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜疾病診斷的光學(xué)性能，又較游離熒光素鈉擁有更快的代謝速率。本研究探討PEI-NHAc-FS NPs在FFA中應(yīng)用和安全性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物取健康棕色雄性挪威大鼠，鼠齡6～8周,體質(zhì)量180～200 g(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)。所有動物均嚴(yán)格按照《視力與眼科動物研究使用說明》和上海市第十人民醫(yī)院《動物研究使用指南》的規(guī)定進(jìn)行護(hù)理和使用，并嚴(yán)格遵守國家衛(wèi)生和醫(yī)學(xué)研究委員會對實(shí)驗(yàn)用動物護(hù)理和使用制定的相關(guān)指南。本研究遵循《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》(2017修訂版)的規(guī)定。

1.1.2 試劑和儀器人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(美國CA公司)，胎牛血清(美國ΜT公司)，支鏈PEI、N-羥基琥珀酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)、10 g·L-1戊巴比妥鈉(美國Sigma公司)，熒光素鈉(廣州白云山明興制藥有限公司)，CCK-8檢測試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，5 g·L-1托吡卡胺(日本參天制藥株式會社)，鹽酸丙美卡因滴眼液(美國愛爾康公司)，AV400核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)，紫外可見光分光光度計(jì)(美國PerkinElmer公司)。

1.2 方法

1.2.1 PEI-NHAc-FS合成將1 mL 熒光素鈉(200 g·L-1)加入10 mol的EDC混合物中攪拌30 min,再加入10 mol的N-羥基琥珀酰亞胺攪拌3 h。然后將該溶液加入到5 mL PEI (76 g·L-1)中，劇烈攪拌3 d獲得PEI-NH2-FS。為了對PEI-NH2-FS進(jìn)行乙?；?，將2 mL三乙胺加入到PEI-NH2-FS原液中，30 min后再將1 mL的乙酸酐加入混合物中攪拌24 h。最后使用磷酸鹽緩沖液對獲得的混合物進(jìn)行透析3 d，隨后對PEI-NHAc-FS進(jìn)行凍干處理。

1.2.2 材料表征分析使用核磁共振波譜儀和紫外可見光吸收光譜觀察PEI-NHAc-FS的結(jié)構(gòu)，并對合成的NPs結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。使用熒光激發(fā)-發(fā)射矩陣熒光光譜法測量熒光素鈉、PEI-NHAc-FS的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長230～500 nm)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)使用含胎牛血清、青霉素-鏈霉素、內(nèi)皮生長補(bǔ)劑的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,放置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞毒性將對數(shù)生長期的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞消化計(jì)數(shù),以每孔5000個(100 μL)鋪入96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，將0～10 μmol·L-1的熒光素鈉和PEI-NHAc-FS加入到96孔板中，并分別培養(yǎng)12 h、24 h后吸盡各孔中培養(yǎng)基，每孔中加入10 μL CCK-8工作液，37 ℃閉光孵育2 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定光密度(D)值，根據(jù)D值計(jì)算細(xì)胞活性。

1.2.5 脈絡(luò)膜新生血管模型構(gòu)建及動物分組根據(jù)既往研究方法，構(gòu)建大鼠脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)模型。腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥鈉30 mL·kg-1麻醉成功后，將挪威大鼠仰臥位固定于操作臺上，局部應(yīng)用5 g·L-1托吡卡胺散瞳，5 g·L-1鹽酸丙美卡因滴眼液局部麻醉。距視盤等距離激光(532 nm)圍繞視盤視網(wǎng)膜光凝，激光功率360 mW,光斑直徑50 μm，曝光時間0.1 s。出現(xiàn)氣泡或輕微出血說明Bruch膜破裂，提示激光誘導(dǎo)CNV大鼠模型成功建立。

取健康棕色雄性挪威大鼠90只，選取30只大鼠，根據(jù)熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs的濃度(5 g·L-1、10 g·L-1、50 g·L-1)將大鼠分為6組，每組5只，即分別于注射前及注射后5 min、20 min、30 min和60 min進(jìn)行眼底照相，采集眼底血管熒光素圖像。用激光誘導(dǎo)大鼠CNV后，取10只大鼠，隨機(jī)分為10 g·L-1熒光素鈉組和PEI-NHAc-FS NPs組，每組5只，分別于注射前及注射后5 min、20 min、30 min和60 min通過眼底血管造影成像觀察病灶處滲漏。另取40只大鼠，隨機(jī)分為10 g·L-1熒光素鈉組和PEI-NHAc-FS NPs組，每組20只，于注射后10 min、20 min、30 min和60 min進(jìn)行熒光冰凍切片。將10只大鼠隨機(jī)分為對照組(注射生理鹽水)和PEI-NHAc-FS NPs組，每組5只，行組織切片HE染色和視網(wǎng)膜電圖檢測。

1.2.6 眼底照相和血管造影按上述方法對大鼠進(jìn)行麻醉及散瞳處理后，通過尾靜脈分別注射不同濃度的熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs(5 g·L-1、10 g·L-1、50 g·L-1)，并于注射前及注射后5 min、20 min、30 min、60 min進(jìn)行眼底照相，采集眼底血管熒光素圖像。

1.2.7 熒光冰凍切片經(jīng)大鼠尾靜脈注射10 g·L-1的熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs，于注射后10 min、20 min、30 min、60 min分批處死大鼠，摘取眼球并在低溫恒溫器中進(jìn)行冰凍切片(厚度約5 μm)，在熒光顯微鏡下觀察切片并拍照。

1.2.8 HE染色經(jīng)尾靜脈向大鼠體內(nèi)注射10 g·L-1的PEI-NHAc-FS NPs，28 d后處死大鼠。取心、脾、腎、肝、大腦、肌肉等組織，用磷酸鹽緩沖液清洗，40 g·L-1多聚甲醛固定，梯度酒精脫水石蠟包埋，切片厚度約為5 μm，行HE染色。用光學(xué)顯微鏡觀察切片并拍照。

1.2.9 視網(wǎng)膜電圖檢測經(jīng)尾靜脈向大鼠體內(nèi)注射10 g·L-1的PEI-NHAc-FS NPs，28 d后記錄視網(wǎng)膜電圖。大鼠暗適應(yīng)16 h后，腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)，肌肉注射甲苯噻嗪(6 mg·kg-1)深度麻醉大鼠。在大鼠鼻、尾和眼角膜分別放置記錄電極、參考電極及接地電極。以發(fā)光二極管(3000 cd·m-2，10 ms)作為刺激器，通過視網(wǎng)膜電流記錄系統(tǒng)檢測視網(wǎng)膜的功能。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PEI-NHAc-FS的表征使用不同的方法對合成的PEI-NHAc-FS NPs進(jìn)行表征檢測。通過核磁共振和紫外可見光吸收光譜觀察到熒光素鈉與PEI成功耦合。發(fā)射熒光光譜顯示，游離熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs的最大發(fā)射波長分別出現(xiàn)在546 nm和544 nm處。

2.2 細(xì)胞毒性檢測結(jié)果CCK-8檢測結(jié)果表明，不同濃度的熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞12 h、24 h后，細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。即使用10 μmol·L-1PEI-NHAc-FS NPs處理24 h和未處理之間細(xì)胞存活率差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 靜脈注射游離熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs后血管熒光強(qiáng)度及大鼠CNV模型診斷結(jié)果FFA圖像記錄了不同時間點(diǎn)靜脈注射5 g·L-1、10 g·L-1、50 g·L-1游離熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs的熒光強(qiáng)度(見圖1)。在5 g·L-1游離熒光素鈉組和PEI-NHAc-FS NPs組中，均僅顯影視網(wǎng)膜主要血管，不能用于FFA的診斷。而在10 g·L-1游離熒光素鈉組和PEI-NHAc-FS NPs組可清晰地顯示視網(wǎng)膜主要血管及微血管的結(jié)構(gòu)，且在注射后30 min時血管熒光強(qiáng)度基本相同。更重要的是， PEI-NHAc-FS NPs組在60 min時熒光強(qiáng)度已基本消失，而游離熒光素鈉組仍保持較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。同時，由于50 g·L-1的PEI-NHAc-FS NPs濃度高，代謝慢，所以本研究采用10 g·L-1PEI-NHAc-FS NPs作為最終濃度。

采用激光光凝建立大鼠CNV模型，尾靜脈分別注射10 g·L-1游離熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs進(jìn)行FFA成像。結(jié)果顯示，造影劑經(jīng)尾靜脈注射后，視網(wǎng)膜血管內(nèi)可見熒光成像，同時病灶部位可見熒光滲漏(見圖2)。

圖1 FFA檢測靜脈注射不同濃度游離熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs后不同時間血管熒光強(qiáng)度 圖中A表示游離熒光素鈉,B表示PEI-NHAc-FS NPs

圖2 注射前及靜脈注射10 g·L-1游離熒光素鈉和 PEI-NHAc-FS NPs后不同時間FFA圖像 箭頭指示病灶

2.4 熒光冰凍切片檢測注射熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs后不同時間視網(wǎng)膜各層熒光強(qiáng)度尾靜脈分別注射10 g·L-1熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs后，于注射后10 min、20 min、30 min、60 min制作冰凍切片并采集熒光圖像。結(jié)果顯示，游離熒光素鈉組在視網(wǎng)膜組織中熒光較強(qiáng)，對視網(wǎng)膜組織有較強(qiáng)的吸附和滲透作用，而PEI-NHAc-FS NPs組在視網(wǎng)膜組織中熒光較弱，對視網(wǎng)膜組織吸附較弱，在體內(nèi)代謝更快(見圖3)。

圖3 熒光冰凍切片檢測靜脈注射10 g·L-1 游離熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs后不同時間視網(wǎng)膜各層熒光強(qiáng)度

2.5 HE染色和視網(wǎng)膜電圖進(jìn)行體內(nèi)生物安全性分析結(jié)果大鼠尾靜脈注射PEI-NHAc-FS NPs后28 d，通過HE染色觀察到心、肝、脾、腎、大腦和肌肉與注射磷酸鹽緩沖液后相比無明顯組織形態(tài)學(xué)改變和損傷(見圖4A)。采用視網(wǎng)膜電圖檢測視網(wǎng)膜功能學(xué)改變發(fā)現(xiàn)，靜脈注射PEI-NHAc-FS NPs后28 d a波振幅為(111.00±6.94)μV，注射磷酸鹽緩沖液后a波振幅為(112.63±20.45)μV，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.310,P>0.05)。注射PEI-NHAc-FS NPs后b波振幅為(341.47±13.07)μV,而注射磷酸鹽緩沖液后b波振幅為(343.42±36.23)μV，兩組差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-0.088,P>0.05)(見圖4B和圖4C)。

3 討論

本研究通過N-羥基琥珀酰亞胺/EDC交聯(lián)法制備PEI-NH2-FS[15]。根據(jù)文獻(xiàn)報道，PEI在成像和藥物傳輸中廣泛應(yīng)用，說明PEI可作為良好的納米載體[6,12]。由于PEI和PEI-NH2-FS表面存在具有毒性的脒基和酰胺原[16-17]，因此我們通過乙?；揎梺斫档筒牧隙拘?，這也為眼底造影劑的安全應(yīng)用提供了保障。此外，熒光光譜法測量結(jié)果表明，在PEI乙?；?，熒光素鈉的熒光性質(zhì)幾乎無變化，仍能對眼底血管有效顯影。

本研究所制備的材料主要優(yōu)點(diǎn)包括：(1)減少了造影劑在患者體內(nèi)的滯留。熒光素鈉是一種小分子產(chǎn)物，作用于細(xì)胞后殘留多，本研究應(yīng)用的新型FFA造影劑可以降低熒光素鈉在細(xì)胞中的滯留率。(2)減小了PEI-NHAc-FS NPs對人血-腦屏障的潛在毒性。研究表明，PEI-NHAc-FS NPs在體內(nèi)和體外對CT/MR成像均具有良好的生物相容性[18-20]。由于酰胺原的乙?；?，PEI-NHAc-FS NPs與未加PEI-NHAc-FS NPs組細(xì)胞存活率無明顯差異。Zhou等[12]研究證實(shí)PEI結(jié)合Au NPs后在一定濃度范圍內(nèi)無細(xì)胞毒性。Calarco等[21]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明，PEI在乙酰化后可以顯著降低基因毒性，提高生物相容性，這與本研究結(jié)果一致?？傊琍EI-NHAc-FS NPs具有良好的細(xì)胞相容性，是一種安全的造影劑。

在臨床診斷中，高濃度的熒光素鈉雖然顯影效果好，但是代謝時間長[22]，如何讓熒光素鈉在保證成像效果的前提下,盡量減少使用濃度和提高代謝速度就成了一個巨大的挑戰(zhàn)。本研究對三種濃度梯度的熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs(5 g·L-1、10 g·L-1、50 g·L-1)進(jìn)行了系統(tǒng)地分析。其中10 g·L-1的游離熒光素鈉和PEI-NHAc-FS NPs在注射后30 min內(nèi)均可清晰地顯示視網(wǎng)膜血管的結(jié)構(gòu),但PEI-NHAc-FS NPs中的熒光素鈉比游離熒光素鈉在血管中清除速度更快；同時PEI-NHAc-FS NPs也能夠準(zhǔn)確、有效診斷CNV滲漏。

正常情況下，造影劑靜脈注射后會隨著血液進(jìn)入全身循環(huán)，甚至對相關(guān)器官造成影響。既往研究發(fā)現(xiàn)，毒性明顯的造影劑會對器官的組織形態(tài)造成影響[23]，但在本研究中，并未出現(xiàn)各器官組織形態(tài)受損情況，說明該新型造影劑是安全的。此外，經(jīng)尾靜脈注射PEI-NHAc-FS NPs后反映光感受器電活動的負(fù)波(a波)和反映Müller細(xì)胞和雙極細(xì)胞的正波(b波)未見明顯變化[24]，說明其對視網(wǎng)膜功能無明顯影響。本研究采用HE染色和視網(wǎng)膜電圖進(jìn)行體內(nèi)生物安全性分析結(jié)果顯示， PEI-NHAc-FS NPs作為造影劑具有良好的生物安全性。

總之，我們合成了用于眼底血管造影的新材料PEI-NHAc-FS NPs。該材料制備方法簡單、生物相容性好、性質(zhì)穩(wěn)定、代謝率高，能有效顯影視網(wǎng)膜血管和CNV滲漏,在FFA診斷中具有廣闊的應(yīng)用前景。