UPLC-QTOF-MS技術(shù)在摩羅丹濃縮丸質(zhì)量穩(wěn)定性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用△

劉會(huì)云，田穎瑞，睢建亮，王夢(mèng)蕾，殷苗苗，王珍

1.邯鄲制藥股份有限公司，河北 邯鄲 056000；2.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200030；3.河北工程大學(xué) 醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北 邯鄲 056000

中成藥有效成分復(fù)雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，其質(zhì)量穩(wěn)定性與中藥材的品種、產(chǎn)地、加工方式，以及成藥的劑型和劑量、制劑加工工藝、制藥設(shè)備、質(zhì)量管理及控制方法、包裝材料等因素有密切關(guān)系。竇志華[1]提出中成藥最突出的問(wèn)題是產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，不同廠家生產(chǎn)的同一產(chǎn)品，甚至是同一廠家不同批次的產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。劉靜等[2]基于國(guó)家樣本抽驗(yàn)工作，提出影響中成藥質(zhì)量和安全的主要問(wèn)題是原料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝。

摩羅丹濃縮丸作為由18味中藥組成的大組方制劑，具有較好的臨床效果[3-5]，其化學(xué)成分復(fù)雜，制劑工藝繁瑣，并且產(chǎn)生藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確；作為復(fù)方制劑，檢測(cè)其中任何一種成分均不能體現(xiàn)其整體質(zhì)量，中藥中所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量能比較全面地反映中藥的內(nèi)在質(zhì)量[6-7]，所以通過(guò)對(duì)比不同批次間樣本所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量可以直接反映樣本的質(zhì)量穩(wěn)定性。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是指液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，適合復(fù)雜體系的成分分析，是目前復(fù)雜體系活性成分快速分離和鑒定的有力手段[8-10]。另外，主成分分析(PCA)在中藥材和中成藥的鑒別與質(zhì)量分析中應(yīng)用也較為廣泛[11-13]。本研究利用超高效液相色譜-四級(jí)桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UPLC-QTOF-MS)技術(shù)對(duì)摩羅丹濃縮丸所含化學(xué)成分進(jìn)行分析，并結(jié)合PCA，對(duì)樣本的質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料

1.1 儀器

Eksigent ekspert型超高效液相儀(AB Sciex公司)；Triple TOF 5600型高分辨質(zhì)譜儀(AB Sciex公司)；Heraeus Fresco17型離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司)；BSA124S-CW型天平(Sartorius公司)；JXFSTPRP-24型研磨儀(上海凈信科技有限公司)；明澈 D24 UV型純水儀(Merck Millipore公司)；PS-60AL型超聲儀(深圳市雷德邦電子有限公司)。

1.2 試藥

甲醇、乙腈、甲酸(LC-MS級(jí)，CNW Technologies公司)；L-2-氯苯丙氨酸(上海恒柏生物科技有限公司,純度≥98%)。

摩羅丹濃縮丸共10個(gè)批次，生產(chǎn)批號(hào)分別為：00518072、00518073、00518074、00518077、00518084、00518086、00518088、00518089、00518090、00518097，由邯鄲制藥股份有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 樣品溶液制備

稱取100 mg摩羅丹濃縮丸粉末，加入500 μL含有內(nèi)標(biāo)(L-2-氯苯丙氨酸)的提取液(80%甲醇，內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度1 μg·mL-1)渦旋混勻30 s；冰水浴中超聲處理1 h；將提取液在4 ℃，12 000 r·min-1(離心半徑為859 mm)離心10 min；取出上清液，即得供試溶液。

2.2 分析方法

色譜條件：色譜柱為UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相0.1%甲酸水溶液(A)-0.1%甲酸-乙腈(B)；梯度洗脫(0～6.5 min，5%～30%B；6.5～12.5 min，30%～70%B；12.5～22 min，70%～100%B)；柱溫為40 ℃。

質(zhì)譜條件：本實(shí)驗(yàn)采用電噴霧離子源，霧化氣壓：377.24 kPa，輔助氣壓：377.24 kPa，氣簾氣壓：241.32 kPa，溫度：550 ℃，噴霧電壓：5500 V(正離子模式)或-4000 V(負(fù)離子模式)。質(zhì)譜儀在控制軟件控制下基于數(shù)據(jù)依賴型掃描(IDA)功能進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。在每個(gè)數(shù)據(jù)采集循環(huán)中，篩選出強(qiáng)度最強(qiáng)且>100的分子離子進(jìn)行對(duì)應(yīng)的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。轟擊能量：40 eV，碰撞能差：20 V，15張二級(jí)譜圖每50 ms。

2.3 數(shù)據(jù)處理

2.3.1數(shù)據(jù)處理方法 將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI軟件，進(jìn)行保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、峰積分、峰對(duì)齊等工作，通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)荷比和二級(jí)質(zhì)譜碎片信息及相應(yīng)裂解規(guī)律匹配法，結(jié)合中藥數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)MS/MS數(shù)據(jù)峰進(jìn)行物質(zhì)鑒定。

2.3.2PCA 本研究使用SIMCA V14.1軟件，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換加中心化(CTR)格式化處理，然后進(jìn)行自動(dòng)建模分析。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

在確定了供試溶液的制備方法和色譜分離條件后，通過(guò)參照相關(guān)文獻(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)摩羅丹濃縮丸UPLC-QTOF-MS分析進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，考察儀器穩(wěn)定性、內(nèi)標(biāo)響應(yīng)情況[6-7]。

2.4.1穩(wěn)定性 取10個(gè)不同批次的摩羅丹濃縮丸，按照2.1項(xiàng)制備方法平行制備得10個(gè)供試溶液，從這10個(gè)供試溶液中分別取出20 μL進(jìn)行混合，得到質(zhì)控(QC)樣品，平行進(jìn)行3次，得到3個(gè)QC樣品，分別為QC-001、QC-002、QC-003；按2.2項(xiàng)下分析方法分別進(jìn)樣進(jìn)行檢測(cè)，QC樣品的檢測(cè)是穿插在10個(gè)供試樣品檢測(cè)中間，并在檢測(cè)結(jié)束后按2.3.2項(xiàng)下分析方法對(duì)QC樣品進(jìn)行PCA。

2.4.2內(nèi)標(biāo)響應(yīng)情況 對(duì)2.4.1項(xiàng)中所得3個(gè)QC樣品中內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-2-氯苯丙氨酸按2.2項(xiàng)下分析方法進(jìn)行檢測(cè)。

3 結(jié)果與討論

3.1 內(nèi)標(biāo)響應(yīng)穩(wěn)定性

通過(guò)對(duì)3個(gè)QC樣品中內(nèi)標(biāo)物L(fēng)-2-氯苯丙氨酸進(jìn)行測(cè)定，得到3個(gè)總離子流分圖譜，對(duì)這3個(gè)譜圖進(jìn)行疊加處理，結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：A.正離子模式；B.負(fù)離子模式；下同。圖1 QC樣品中內(nèi)標(biāo)L-2-氯苯丙氨酸的總離子流分圖

由圖1可以看到，正負(fù)離子模式下，QC樣品中內(nèi)標(biāo)L-2-氯苯丙氨酸在總離子流分圖中色譜峰的保留時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度重疊性較好，說(shuō)明儀器在數(shù)據(jù)采集過(guò)程中的穩(wěn)定性較好。

內(nèi)標(biāo)為外源引入的物質(zhì)，QC樣品中內(nèi)標(biāo)濃度相同，所以內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)差異越小(RSD≤20%)，說(shuō)明系統(tǒng)越穩(wěn)定，數(shù)據(jù)質(zhì)量越高。通過(guò)對(duì)QC樣品中內(nèi)標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)差異分析，得出內(nèi)標(biāo)L-2-氯苯丙氨酸在QC樣品中正、負(fù)離子模式下響應(yīng)差異RSD分別為14.3%和15.7%，均小于20%，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，系統(tǒng)較穩(wěn)定。

3.2 摩羅丹濃縮丸的UPLC-QTOF-MS檢測(cè)結(jié)果及不同批次樣品間質(zhì)量評(píng)價(jià)

3.2.1摩羅丹濃縮丸總離子流分圖分析 因QC樣品是由10個(gè)不同批次摩羅丹濃縮丸的供試品溶液混合得到的，為排除不同批次樣本所含化學(xué)成分的差異，在對(duì)摩羅丹濃縮丸中所含化學(xué)成分進(jìn)行定性分析的研究中，選擇了QC樣品作為研究對(duì)象。由于方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果良好，按2.2項(xiàng)下分析方法對(duì)QC-001樣品進(jìn)行測(cè)定，得到總離子流分圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 摩羅丹濃縮丸QC樣品總離子流分圖

采用UPLC-QTOF-MS對(duì)摩羅丹濃縮丸樣品進(jìn)行測(cè)定，得到摩羅丹濃縮丸QC-001樣品總離子流分圖，根據(jù)該總離子流分圖，按照2.3.1的數(shù)據(jù)處理方法，對(duì)總離子流分圖中色譜峰進(jìn)行物質(zhì)鑒定。在正離子模式下，摩羅丹濃縮丸共鑒定出214種化學(xué)成分；負(fù)離子模式下，共鑒定出164種化學(xué)成分，正負(fù)離子模式下相同化學(xué)成分11種，所以摩羅丹濃縮丸中共鑒定出367種化學(xué)成分。

摩羅丹濃縮丸作為一個(gè)大處方制劑，所含化學(xué)成分較復(fù)雜，根據(jù)該藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，僅有3項(xiàng)鑒別項(xiàng)和1項(xiàng)含量測(cè)定項(xiàng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以反映藥品的質(zhì)量情況，這也是中藥在質(zhì)量控制方面的難點(diǎn)，利用UPLC-QTOF-MS技術(shù)快速一次性鑒定出該藥品中所含的367種化學(xué)成分，能夠較為全面地反映藥品的質(zhì)量情況。

根據(jù)中藥化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)類型，對(duì)鑒定出的化學(xué)成分進(jìn)行進(jìn)一步分類，摩羅丹濃縮丸中含有64種三萜類物質(zhì)、38種黃酮類物質(zhì)、33種生物堿類物質(zhì)、33種萜類物質(zhì)、12種糖和苷類物質(zhì)、10種有機(jī)酸及脂肪酸類物質(zhì)、9種苯丙素類物質(zhì)、4種氨基酸類及3種醌類物質(zhì)等，其中三萜類、黃酮類、生物堿類及萜類數(shù)量較多，文獻(xiàn)[14-15]表明，這幾個(gè)種類中含有很多抗炎、抗菌、抗氧化藥理作用的化學(xué)成分，通過(guò)對(duì)這些化學(xué)成分的進(jìn)一步研究，能夠進(jìn)一步了解該藥品的作用機(jī)理。

基于摩羅丹濃縮丸成分復(fù)雜多樣，為了能夠?qū)ζ涑煞指尤娑到y(tǒng)的分析，筆者利用數(shù)據(jù)庫(kù)，包括中科院上海有機(jī)所化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(www.organchem. csdb.cn)、臺(tái)灣中醫(yī)藥資料庫(kù)(http：//tcm.cmu. edu.tw/)、Google scholar、Medline、CNKI、PubMed，根據(jù)摩羅丹濃縮丸組方中的藥材，對(duì)這367種化學(xué)成分進(jìn)行了藥材一般來(lái)源歸屬，具體藥材歸屬見(jiàn)表1。從表1可以看出，18味藥材中鑒定出的化學(xué)成分?jǐn)?shù)量不盡相同，其中來(lái)自茵陳、玄參、三七和延胡索中的化學(xué)成分較多，均超過(guò)30種。

表1 摩羅丹濃縮丸中所含化合物藥材歸屬統(tǒng)計(jì)

3.2.2不同批次摩羅丹濃縮丸所含化學(xué)成分重復(fù)率分析 為了研究摩羅丹濃縮丸不同批次間的質(zhì)量穩(wěn)定性，本研究通過(guò)UPLC-QTOF-MS對(duì)10個(gè)不同批次的摩羅丹濃縮丸供試品溶液進(jìn)行分析，得到各個(gè)批次樣品的總離子流分色譜圖，對(duì)這10個(gè)圖譜進(jìn)行了疊加處理，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 10個(gè)不同批次摩羅丹濃縮丸總離子流分疊加圖

從圖3中可以看出，正負(fù)離子模式下10個(gè)不同批次摩羅丹濃縮丸總離子流分圖能夠較好地重疊，從出峰時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度的重疊情況來(lái)看，樣本各批次間所含化學(xué)成分種類及含量上均較相似，說(shuō)明摩羅丹濃縮丸樣本各批次質(zhì)量差異性較小，總體質(zhì)量穩(wěn)定性較好。采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)獲得藥品的總離子流分圖，能夠較全面地反映出藥品的整體質(zhì)量，該方法較穩(wěn)定，且可重復(fù)性高。

為了更清晰地應(yīng)用UPLC-QTOF-MS技術(shù)來(lái)表達(dá)各批次間樣品所含化學(xué)成分種類的重復(fù)率，對(duì)各批樣品鑒定出的化學(xué)成分種類及數(shù)量進(jìn)行了進(jìn)一步分析，結(jié)果見(jiàn)表2～4。

表2 正離子模式下不同批次樣品所含化學(xué)成分重復(fù)率

表3 負(fù)離子模式下不同批次樣品所含化學(xué)成分重復(fù)率

表4 正負(fù)離子模式下不同批次樣品所含化學(xué)成分重復(fù)率

從表2～3可以看出，10個(gè)不同批次摩羅丹濃縮丸在正離子模式下鑒定出的化合物數(shù)量從193～209不等，不同批次樣品間共有化合物數(shù)量為185個(gè)，所含化學(xué)成分的平均重復(fù)率為90%；負(fù)離子模式下鑒定出的化合物數(shù)量從154～159不等，不同批次樣本間共有化合物數(shù)量為151個(gè)，所含化學(xué)成分的平均重復(fù)率達(dá)到96%。

從表4中可以看出，10個(gè)不同批次摩羅丹濃縮丸樣品鑒定出總化學(xué)成分?jǐn)?shù)量差距較小，最少341個(gè)，最多359個(gè)，共有化學(xué)成分為325個(gè)，各批次間所含共有化學(xué)成分的平均重復(fù)率達(dá)到92%。從不同批次樣品所含化學(xué)成分種類的重復(fù)率角度來(lái)看，說(shuō)明摩羅丹濃縮丸樣品各批次質(zhì)量差異性較小，質(zhì)量穩(wěn)定性較好。

3.2.3不同批次摩羅丹濃縮丸樣品PCA 為從整體上比較摩羅丹濃縮丸不同批次間的質(zhì)量穩(wěn)定性，本研究按照2.3.2項(xiàng)下分析方法對(duì)10個(gè)批次的摩羅丹濃縮丸樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行了PCA，得到10個(gè)批次樣品PCA質(zhì)量得分散點(diǎn)分布圖和質(zhì)量得分一維分布圖，結(jié)果見(jiàn)圖4～5。

圖4 10個(gè)不同批次摩羅丹濃縮丸樣品(n=10)PCA質(zhì)量得分散點(diǎn)分布圖

圖4中橢圓代表95%置信區(qū)間，從圖4可以看出，在正離子模式下00518073批次樣品在第一主成分上與其他批次之間有分離趨勢(shì)，而00518072和00518089批次樣品在第二主成分上與其他批次之間有分離趨勢(shì)，其他批次均較集中。結(jié)合圖5樣品PCA質(zhì)量得分一維分布圖可以看出，除00518073批外，其他批次質(zhì)量小于2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差；在負(fù)離子模式下，從圖4中可以看出各批次之間分布較離散，但結(jié)合圖5發(fā)現(xiàn)，負(fù)離子模式下所有批次質(zhì)量小于2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差；表明不同批次樣品之間差異較小，總體質(zhì)量較為穩(wěn)定。綜上所述，通過(guò)10個(gè)不同批次樣品數(shù)據(jù)的PCA得出，摩羅丹濃縮丸藥品總體質(zhì)量穩(wěn)定性較好，個(gè)別批次間略有差異。利用UPLC-QTOF-MS技術(shù)，結(jié)合PCA方法，能夠從另一角度反映出藥品多批次間的質(zhì)量穩(wěn)定性。

圖5 10個(gè)不同批次摩羅丹濃縮丸樣品PCA質(zhì)量得分一維分布圖

4 結(jié)論

本研究利用UPLC-QTOF-MS技術(shù)對(duì)摩羅丹濃縮丸的化學(xué)成分進(jìn)行測(cè)定，鑒定出其含有367種化學(xué)成分，其中三萜類、黃酮類、生物堿類及萜類數(shù)量較多，比較全面地反映了摩羅丹濃縮丸的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量情況，同時(shí)也為下一步該藥品的藥理作用研究提供參考；另外，通過(guò)對(duì)比10個(gè)不同批次樣品所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，得出不同批次樣品所含化學(xué)成分的平均重復(fù)率達(dá)到92%，進(jìn)一步結(jié)合PCA結(jié)果，利用UPLC-QTOF-MS技術(shù)對(duì)摩羅丹濃縮丸的整體質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行了更加全面地評(píng)價(jià)，10個(gè)批次樣品除1個(gè)批次外的其他批次間的質(zhì)量偏差較小，證明該藥品的總體質(zhì)量穩(wěn)定性較好，個(gè)別批次之間略有輕微差異。本研究將UPLC-QTOF-MS技術(shù)應(yīng)用到中藥制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)中，應(yīng)用性強(qiáng)、穩(wěn)定性高，為中藥制劑的質(zhì)量穩(wěn)定性評(píng)價(jià)系統(tǒng)的建立提供了思路。