基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接探討木瓜治療膝骨關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制△

時(shí)孝晴，梅偉，茆軍，張農(nóng)山，邢潤麟，殷松江，王培民

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種中老年常見、多發(fā)疾病。伴隨全球人口老齡化的不斷發(fā)展，KOA的發(fā)病率逐年遞增，逐漸成為全球范圍內(nèi)的公共健康挑戰(zhàn)[1]。多數(shù)KOA患者臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)酸痛不適，當(dāng)疾病進(jìn)一步進(jìn)展時(shí)，患者膝部常疼痛難忍，嚴(yán)重影響其生活質(zhì)量，甚至最終導(dǎo)致殘疾。木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomelesspeciosa(Sweet) Nakai的干燥近成熟果實(shí)，性味酸、溫，歸肝、脾二經(jīng)，主要用于濕痹拘攣、腰膝關(guān)節(jié)酸重疼痛、吐瀉轉(zhuǎn)筋、腳氣水腫等?！度沼帽静荨酚涊d：“木瓜治腳氣上攻，腿膝疼痛，止渴消腫”?！妒朝煴静荨芬嘤涊d：“煮木瓜令爛，研作漿粥樣，用裹痛處，冷即易，一宿三、五度，熱裹便差。煮木瓜時(shí)，入一半酒同煮之，治腳膝筋急痛”。《本事方》中記載：“木瓜煎可治筋急項(xiàng)強(qiáng)，不可轉(zhuǎn)側(cè)”。在臨床運(yùn)用木瓜時(shí)，雖不將木瓜作君藥使用，但以木瓜為臣、為佐，常起到良效。正如《本草新編》曰：“木瓜，但可臣、佐、使，而不可以為君，乃入肝益筋之品，養(yǎng)血衛(wèi)腳之味，最宜與參、術(shù)同施，歸、熟(地)并用”。木瓜治療KOA療效確切，但其具體作用機(jī)制尚不清楚。

隨著現(xiàn)代藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)逐漸成為一種新型疾病-藥物預(yù)測(cè)模式[2]。其在“藥物-靶點(diǎn)-疾病”的理論框架下，深度挖掘藥物數(shù)據(jù)庫、疾病數(shù)據(jù)庫、基因數(shù)據(jù)庫等，并以網(wǎng)絡(luò)圖的形式進(jìn)行展示，借以闡釋復(fù)雜的藥物如何作用于人體。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多通道的復(fù)雜特點(diǎn)，這一特征與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性相一致。近年來，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥的作用機(jī)制取得了巨大進(jìn)步，成為探索中醫(yī)藥治療疾病具體靶點(diǎn)與通路的有力工具。故本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探索木瓜的靶點(diǎn)、通路以及藥物有效成分之間的互作關(guān)系，為其治療KOA提供機(jī)制理論支撐。

1 資料與方法

1.1 化合物成分收集與篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)中檢索木瓜的中藥化學(xué)成分信息，其篩選條件設(shè)置為藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18，獲取藥物活性成分[3-4]。

1.2 木瓜及KOA相關(guān)作用靶點(diǎn)獲取

以“knee osteoarthritis”作為關(guān)鍵詞，通過GeneCards(https：//www.genecards.org/)與OMIM(https：//www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫，檢索并篩選與KOA相關(guān)的作用基因。通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www. uniprot.org/uniprot/)將2.1項(xiàng)中所獲得的藥物作用靶標(biāo)轉(zhuǎn)化為與GeneCard數(shù)據(jù)庫相匹配的基因名稱(gene name)。最后，將木瓜活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果和KOA相關(guān)靶標(biāo)的檢索結(jié)果進(jìn)行匹配，并選擇重疊靶點(diǎn)作為木瓜治療KOA的核心靶點(diǎn)。利用Venny 2.1(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具進(jìn)行木瓜活性成分靶點(diǎn)和KOA靶點(diǎn)的映射并繪制韋恩圖。

1.3 藥物活性成分與疾病作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將木瓜的活性成分和KOA相關(guān)靶點(diǎn)篩選結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape Version 3.7.1軟件[5]，構(gòu)建木瓜活性成分與KOA靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。其網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)(node)表示靶點(diǎn)或活性成分，邊(edge)表示其相互作用。Cytoscape軟件的核心架構(gòu)是網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)是基因、蛋白質(zhì)或分子，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接代表這些生物分子之間的相互作用。節(jié)點(diǎn)的度值(degree)代表網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)相連的數(shù)目，度值越大，這個(gè)靶點(diǎn)越有可能成為化合物的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心基因篩選

String數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)收集了大量蛋白相互作用關(guān)系，并給出了數(shù)據(jù)置信范圍(低置信度：<0.4；中等置信度：0.4～0.7；高等置信度：>0.7)。在此基礎(chǔ)上，將木瓜的蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，物種限定Homo sapiens，置信度為0.7，進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。將該圖導(dǎo)入Cytoscape version 3.7.1軟件進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?。借助“Network analyzer”功能，計(jì)算參與互作靶蛋白的度值和介數(shù)(betweenness)。PPI網(wǎng)絡(luò)連線的粗細(xì)代表互相作用的強(qiáng)弱，靶點(diǎn)的度值反映了1個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的連接數(shù)目，度值越大代表此節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的關(guān)系更緊密，在網(wǎng)絡(luò)中地位越重要。對(duì)度值按降序進(jìn)行排序，篩選出序號(hào)前20的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)，借助R project軟件繪制條形圖，顯示基因名與其連接節(jié)點(diǎn)數(shù)目。

1.5 GO與KEGG富集分析

使用半編程性質(zhì)的腳本性軟件R project，可實(shí)現(xiàn)多種生物信息分析與結(jié)果可視化。先利用RGUI及org.Hs.eg.db獲取核心靶點(diǎn)的entrezID，然后利用RGUI、DOSE及ClusterProfiler對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集(molecular function，MF；biological process，BP；cellular component，CC)及KEGG通路進(jìn)行富集。在程序語言中，將Pvalue Cutoff=0.05，Qvalue Cutoff=0.05，分析結(jié)果選擇富集程度最高的前20條，選擇氣泡圖的形式予以展示。最后利用R project軟件及pathview，通過KEGG數(shù)據(jù)庫(KEGG，https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html)下載富集排名前20名通路。通過人工查閱相關(guān)文獻(xiàn)及反復(fù)對(duì)比篩選后，最終納入結(jié)果。

1.6 分子對(duì)接

Discovery Studio 2016 3.0是一個(gè)新一代分子建模和模擬環(huán)境，應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究以及藥物發(fā)現(xiàn)。采用Discovery Studio 2016 3.0對(duì)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中度值靠前的3個(gè)靶點(diǎn)與木瓜藥效成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。保存分子對(duì)接結(jié)果，并對(duì)其LibDock score進(jìn)行分析，用以評(píng)價(jià)木瓜活性成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合活性。并用臨床上廣泛應(yīng)用于治療KOA的陽性藥物塞來昔布(celecoxib)進(jìn)行對(duì)照分析。

1.6.1活性成分與KOA作用靶點(diǎn)晶體的獲取 通過活性成分與疾病作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，得到木瓜的類藥成分與KOA作用靶標(biāo)。上述類藥成分、塞來昔布(陽性對(duì)照藥物)的mol2結(jié)構(gòu)和KOA相關(guān)靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，分別通過Chemical Book數(shù)據(jù)庫(https：//www.chemicalbook.com/)、RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https：//www.rcsb.org/)下載。

1.6.2對(duì)接步驟及結(jié)果評(píng)價(jià) 將1.6.1得到的結(jié)果依次導(dǎo)入Discovery Studio 2016 3.0軟件，進(jìn)行預(yù)處理。首先對(duì)每個(gè)類藥成分進(jìn)行Prepare Ligands，參數(shù)為默認(rèn)值，保存為分子對(duì)接配體。其次通過Prepare Protein，參數(shù)取默認(rèn)值，得到預(yù)處理蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，抽離靶點(diǎn)原配體，保存為分子對(duì)接受體。受體活性位點(diǎn)選擇原配體抽離位置，在LibDock模塊設(shè)定Docking Preferences為High Quality，對(duì)接匹配方法(Conformation Method)為BEST，Parallel Processing為True，其他參數(shù)取默認(rèn)值。對(duì)接結(jié)果以打分函數(shù)LibDock score給出，LibDock score越高，預(yù)測(cè)成分與靶點(diǎn)結(jié)合的活性越高。

2 結(jié)果

2.1 木瓜活性成分的篩選

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，篩選條件為OB≥30%、DL≥0.18，共檢索到木瓜中包含4個(gè)活性成分，對(duì)4個(gè)活性成分進(jìn)行手工檢索相關(guān)靶點(diǎn)，最終納入3個(gè)有效活性成分,包括槲皮素、白樺脂酸、表兒茶酸，見表1。

表1 TCMSP中木瓜的活性成分

2.2 木瓜活性成分靶點(diǎn)庫與KOA作用靶點(diǎn)集的構(gòu)建

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫中成分靶點(diǎn)，其收錄的木瓜中成分作用靶點(diǎn)共162個(gè)。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫收集作用靶點(diǎn)的基因名(gene name)，刪除無效與重復(fù)的靶點(diǎn)，最后得到78個(gè)活性成分作用靶標(biāo)。通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫檢索整合得到1543個(gè)KOA相關(guān)基因靶點(diǎn)。將78個(gè)活性藥物靶點(diǎn)與1543個(gè)KOA相關(guān)靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，得到44個(gè)共同靶點(diǎn)基因，韋恩圖見圖1，具體藥物活性成分靶標(biāo)見表2。

圖1 KOA靶點(diǎn)與木瓜成分靶點(diǎn)韋恩圖

表2 木瓜治療KOA潛在靶標(biāo)信息

2.3 構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將3種藥物活性成分和44個(gè)疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果進(jìn)行映射，去除無對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的化學(xué)成分，并刪除重復(fù)的靶點(diǎn)。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建藥物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)交集網(wǎng)絡(luò)，見圖2。由圖2可得，此網(wǎng)絡(luò)共包括節(jié)點(diǎn)50個(gè)，邊93個(gè)。木瓜的1種活性成分可對(duì)應(yīng)1個(gè)或多個(gè)疾病靶標(biāo)，多種藥物活性成分可對(duì)應(yīng)相同的疾病靶標(biāo)，提示木瓜治療KOA具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn)。

注：綠色橢圓形代表中藥名稱；紫色八邊型代表疾病名稱；青色三角形代表藥物有效成分；藍(lán)色四邊形代表疾病作用靶標(biāo)。圖2 中藥化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將木瓜可能治療KOA的44個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，獲取其相互作用關(guān)系并保存PPI網(wǎng)絡(luò)圖與TSV格式文件，見圖3。PPI網(wǎng)絡(luò)中共包含節(jié)點(diǎn)44個(gè)，邊122條。充分體現(xiàn)了中藥治療疾病作用機(jī)制的復(fù)雜性。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，度值較高即處于較為核心位置的靶點(diǎn)包括VEGFA、IL6、ESR1、CASP3等。利用R軟件繪制條形圖，展示了PPI網(wǎng)絡(luò)中度值中心性較高的前20位的靶點(diǎn)，見圖4。

圖3 木瓜治療KOA潛在作用靶點(diǎn)間的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前20的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.5 GO和KEGG通路富集分析

分析44個(gè)核心靶點(diǎn)主要富集的分子功能、生物過程、細(xì)胞成分。結(jié)果顯示，木瓜治療KOA的核心靶點(diǎn)共在65個(gè)GO term上富集。其中所涉及的生物學(xué)功能與過程主要包括RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性參與轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)異二聚化活性、RNA聚合酶II核心啟動(dòng)子近端區(qū)序列特異性DNA結(jié)合、核心啟動(dòng)子近端區(qū)序列特異性DNA結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、配體激活的序列特異性DNA結(jié)合RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性等，與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡及調(diào)控細(xì)胞代謝等生物學(xué)過程密切相關(guān)。以P<0.05為閾值篩選排名前20的GO分析結(jié)果，見圖5。對(duì)木瓜治療KOA的44個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，分析結(jié)果顯示，共富集在83條通路上，其中與KOA通路相關(guān)的主要包括細(xì)胞凋亡、PI3K-Akt、腫瘤壞死因子(TNF)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)以及p53信號(hào)通路等。這些經(jīng)典信號(hào)通路對(duì)KOA的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用。以P<0.05為閾值篩選排名前20的KEGG分析結(jié)果，見圖6。GO和KEGG分析提示木瓜可以通過以上多條通路作用于KOA。

圖5 木瓜活性成分潛在治療KOA靶點(diǎn)的GO功能分析

圖6 木瓜活性成分潛在治療KOA靶點(diǎn)的KEGG富集分析

2.6 靶點(diǎn)通路分析

利用KEGG Mapper工具獲取木瓜治療KOA的通路圖(見圖7)。木瓜與KOA相關(guān)靶點(diǎn)標(biāo)記為紅色。細(xì)胞凋亡通路圖顯示，木瓜治療KOA涉及12個(gè)效應(yīng)靶點(diǎn)。

2.7 分子對(duì)接分析

Discovery Studio分子對(duì)接驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)。LibDock score代表分子對(duì)接吻合度，分?jǐn)?shù)越高代表配體與受體蛋白結(jié)合性越好。分子對(duì)接結(jié)果表明，木瓜活性成分與KOA部分關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接吻合度較好。木瓜活性成分與塞來昔布相比，分子對(duì)接吻合度無明顯差異。與此同時(shí)，也間接驗(yàn)證了木瓜對(duì)于KOA的VEGFA、IL6、ESR1等靶點(diǎn)具有調(diào)節(jié)作用。分子對(duì)接結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果一致，用分子對(duì)接的方式驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的可靠性。木瓜成分配體與KOA靶蛋白受體的對(duì)接結(jié)果見表3，對(duì)接過程見圖8。

注：紅色表示木瓜治療KOA靶點(diǎn)。圖7 木瓜在細(xì)胞凋亡通路中的作用靶點(diǎn)

表3 配體受體蛋白分子對(duì)接的結(jié)果

注：A.IL6與塞來昔布對(duì)接過程；B.IL6與表兒茶酸對(duì)接過程；C.VEGFA與表兒茶酸對(duì)接過程；D.VEGFA與塞來昔布對(duì)接過程；E.ESR1與槲皮素對(duì)接過程；F.ESR1與塞來昔布對(duì)接過程。圖8 木瓜活性成分、塞來昔布和KOA相關(guān)靶點(diǎn)的部分對(duì)接過程

3 討論

KOA是一種慢性關(guān)節(jié)退變性疾病，其主要表現(xiàn)在于關(guān)節(jié)軟骨退化、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨的反應(yīng)性增生[6]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，60歲以上人群當(dāng)中，全球KOA患病率達(dá)10%以上，而中國農(nóng)村人群中其患病率超過16%，給患者、家庭及社會(huì)帶來了較為沉重的經(jīng)濟(jì)壓力[7]?，F(xiàn)在臨床常用于治療KOA的藥物，如非甾體抗炎藥(NSAID)，存在消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等不良反應(yīng)。與此同時(shí)，葡萄糖胺和軟骨素等軟骨保護(hù)劑與安慰劑組相比，亦沒有顯著的臨床益處[8]。中醫(yī)中藥的簡、便、廉、效及其較小的不良反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)逐漸凸顯。

祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為KOA屬于“痹癥”范疇。木瓜具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕的功效，可用于治療濕痹拘攣、腰膝關(guān)節(jié)酸重疼痛。木瓜治療KOA療效顯著，但更為確切的治療靶點(diǎn)、通路不清，缺乏相關(guān)分子層面的研究。KOA-木瓜靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)揭示，引起KOA的靶點(diǎn)眾多，且靶點(diǎn)之間存在著復(fù)雜的作用關(guān)系，并非單一靶點(diǎn)起作用。中藥治療KOA具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析有利于從分子水平闡明其作用機(jī)制。

通過檢索數(shù)據(jù)庫并設(shè)置篩選條件，最終得到3個(gè)有效活性成分，包括槲皮素、白樺脂酸與表兒茶酸?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素具有抑制膝關(guān)節(jié)中軟骨細(xì)胞凋亡、減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解的作用[9-12]。表兒茶酸對(duì)成骨細(xì)胞具有雙向調(diào)節(jié)作用，在中低濃度時(shí)可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，高濃度時(shí)對(duì)其產(chǎn)生抑制作用[13]。白樺脂酸呈劑量依賴性的抑制了白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-3、MMP-13、前列腺素E2(PGE2)和一氧化氮(NO)生成，其可能是通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)來抑制IL-1β誘導(dǎo)的KOA[14]。

此項(xiàng)研究通過木瓜靶點(diǎn)與KOA靶點(diǎn)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，基于節(jié)點(diǎn)的度值，對(duì)包括VEGFA、IL6、ESR1、CASP3、CCND1等排名前20的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了排序。KEGG通路富集與靶點(diǎn)通路分析顯示，KOA發(fā)生機(jī)制與相關(guān)靶點(diǎn)及其所分布的通路有密切關(guān)聯(lián)。這與目前對(duì)上述中藥活性成分及其關(guān)鍵靶點(diǎn)的研究結(jié)果和其與KOA間關(guān)系的相關(guān)研究基本一致。

VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族的成員，其表達(dá)水平降低可以增強(qiáng)軟骨形成和預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎的疾病進(jìn)展[15]。其原因可能由apelin介導(dǎo)的滑膜VEGF參與了KOA的疼痛通路[16]。同時(shí)研究表明，抑制VEGF不僅可以增強(qiáng)軟骨細(xì)胞分化，還可以保護(hù)軟骨細(xì)胞免受TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(ERK1/2)的磷酸化[17]。IL-6是一種強(qiáng)烈激活免疫系統(tǒng)并增強(qiáng)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，其參與各種炎性疾病的發(fā)病過程。對(duì)IL-6進(jìn)行抑制，一方面減少了碘乙酸單鈉誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎(OA)大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶弁葱袨?，另一方面，通過阻斷IL-6或信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白-3(STAT-3)，可以減輕內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)造成的OA大鼠的疼痛癥狀[18]。ESR1屬于配體調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的核受體(NR)超家族，可表達(dá)于成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞中E2靶向活化ESR1，通過抑制ERK磷酸化激活，進(jìn)而抑制ERK信號(hào)通路，促進(jìn)自噬流的形成，激活自噬，減少凋亡，進(jìn)而引起軟骨細(xì)胞的增殖[19-20]。Meta分析及基因相關(guān)性研究同樣顯示，ESR1基因與KOA具有相關(guān)性[21-22]。CASP3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶。Takada等[23]發(fā)現(xiàn),OA的病理進(jìn)展與細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，CASP3活化與軟骨退變、軟骨細(xì)胞凋亡具有相關(guān)性。在KOA人群中CCND1的表達(dá)下調(diào)，且隨著KOA嚴(yán)重程度的增加，其下調(diào)越多。當(dāng)CCND1過表達(dá)時(shí)，其可以逆轉(zhuǎn)FOXD2-AS1抑制對(duì)軟骨細(xì)胞活力的影響[24-25]。

根據(jù)GO注釋結(jié)果可知，木瓜主要通過影響關(guān)節(jié)軟骨代謝、生長和修復(fù)，細(xì)胞增殖、分化、凋亡和抵抗氧化應(yīng)激、炎癥等通路而發(fā)揮治療KOA的作用。通過KEGG富集分析，其結(jié)果主要富集在細(xì)胞凋亡、TNF、NF-κB、p53、AGE-RAGE等信號(hào)通路。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種程序化死亡?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控KOA軟骨細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路復(fù)雜多樣，如PI3k/Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、MAPK/JNK信號(hào)通路、MAPK/ERK1/2信號(hào)通路、TLR4信號(hào)通路等[26-28]。p53是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)中發(fā)揮重要作用，當(dāng)發(fā)生物理損傷、缺氧、代謝異常時(shí)可引起p53的過度表達(dá)，過度表達(dá)的p53能夠刺激Bax基因表達(dá)增加，使Bax和Bcl-2的比例失調(diào)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[29]。在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，過度表達(dá)的p53作用于線粒體，使其膜電位以及通透性改變，釋放細(xì)胞色素C，從而激活Caspase-3，亦引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生[30]。TNF-α是促炎細(xì)胞因子的一種，其在炎癥過程中發(fā)揮重要作用[31]。TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生MMP，包括MMP-1、MMP-3、MMP-13及ADAMTS-5等[32]。同時(shí)TNF-α能夠激活NF-κB信號(hào)通路，使得TNF-α的促炎功能進(jìn)一步加強(qiáng)[33]。?zler等[34]發(fā)現(xiàn)，在晚期KOA患者的血清與膝關(guān)節(jié)滑液中的TNF-α升高與疾病等級(jí)呈正相關(guān)。隨著疾病嚴(yán)重程度的進(jìn)展，滑液MMP-13和血清TNF-α水平明顯增加，但TNF-α水平是一種全身性升高，MMP-13水平則在局部升高。在關(guān)節(jié)炎組織中，NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑可以被促炎細(xì)胞因子、機(jī)械應(yīng)激和細(xì)胞外基質(zhì)降解產(chǎn)物激活，這種活化可以調(diào)節(jié)許多細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子和幾種基質(zhì)降解酶的表達(dá)[35]。在KOA的病理進(jìn)展中，其被KOA軟骨細(xì)胞活化。NF-κB信號(hào)通路不僅與促炎、應(yīng)激等相關(guān)，而且該通路的激活可促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化為肥大樣狀態(tài)[36]。持續(xù)的NF-κB活化可誘導(dǎo)ELF3、HIF2、RUNX2等轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而引發(fā)MMP-13和ADAMTS5蛋白酶的產(chǎn)生，其促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞從前肥大狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榻K末分化肥大狀態(tài)[36]。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和技術(shù)，篩選出木瓜中3種藥物活性成分和81個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。共有1543個(gè)KOA疾病相關(guān)靶標(biāo)，其中44個(gè)是木瓜-KOA的共同靶標(biāo)。通過對(duì)GO生物過程和KEGG信號(hào)通路的富集分析，初步預(yù)測(cè)木瓜可能通過槲皮素、白樺脂酸、表兒茶酸等有效活性成分調(diào)控VEGFA、IL6、ESR1、CASP3、CCND1等靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、TNF、p53、NF-κB、AGE-RAGE等信號(hào)通路，最終抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫功能，干預(yù)細(xì)胞凋亡過程，從而治療KOA。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果一方面說明了引起KOA因素多且復(fù)雜，另一方面也直觀的表明了木瓜多成分、多途徑、多靶點(diǎn)治療KOA的特點(diǎn)，研究結(jié)果有助于對(duì)KOA發(fā)病機(jī)制的理解，并在預(yù)防和治療KOA方面拓展了新的治療策略。但由于數(shù)據(jù)庫、相應(yīng)的分析算法和各種平臺(tái)的軟件功能的局限性，其結(jié)果可作為開展實(shí)驗(yàn)研究的線索，但具體機(jī)制有待實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。