蛋白原核表達(dá)技術(shù)在本科開放實(shí)驗(yàn)中的設(shè)計(jì)與實(shí)踐

謝 鑫 陳美晴 王 勇 蔣君梅 任明見

（貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院 貴州·貴陽(yáng) 550025）

蛋白是生物體行使其物理、化學(xué)特性和功能的重要基礎(chǔ)。大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)是開發(fā)最早、應(yīng)用最廣的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。它通過(guò)將克隆的目的基因插入原核表達(dá)載體，隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，再通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)、純化，獲得目的蛋白。[1]原核表達(dá)技術(shù)具有遺傳背景清楚、生長(zhǎng)速度快周期短、蛋白表達(dá)水平高、抗污染能力強(qiáng)、可大規(guī)模培養(yǎng)、成本低、易操作、蛋白表達(dá)載體種類多、適用范圍廣等特點(diǎn)，是重組蛋白表達(dá)的理想系統(tǒng)，被廣泛應(yīng)用于重組蛋白表達(dá)。[2-4]但原核表達(dá)的效率易受到誘導(dǎo)菌株類型、誘導(dǎo)溫度范圍、誘導(dǎo)劑濃度等因素的影響。[5]隨著遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，對(duì)重組功能性蛋白質(zhì)的市場(chǎng)需求急劇增加，首要條件就是要獲得大量表達(dá)蛋白（高度純化且折疊正確的蛋白質(zhì)），[6]為實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)產(chǎn)品的商業(yè)化和其功能及相互作用進(jìn)行系統(tǒng)分析。但獲取大量高純度蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性研究和生物技術(shù)產(chǎn)品開發(fā)中經(jīng)常會(huì)成為瓶頸現(xiàn)象，嚴(yán)重限制蛋白功能性的后續(xù)研究，所以蛋白質(zhì)的表達(dá)技術(shù)是必不可少的。

近年來(lái)，原核表達(dá)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白結(jié)構(gòu)與功能分析、抗體生產(chǎn)、蛋白質(zhì)相互作用等方面。[7]運(yùn)用該技術(shù)可以提供足夠的人工抗原，用于蛋白質(zhì)的快速鑒定和結(jié)構(gòu)分析。隨著對(duì)基因功能學(xué)研究的不斷深入，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室也在嘗試用原核細(xì)胞表達(dá)蛋白。本次開放教學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)原核表達(dá)技術(shù)在本科教學(xué)中進(jìn)行探索，并對(duì)蛋白可溶性表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高蛋白表達(dá)效率。

為了提高學(xué)生對(duì)原核表達(dá)技術(shù)的理解和掌握，更加直觀清晰地了解原核表達(dá)技術(shù)，幫助他們深入了解相關(guān)的分子生物學(xué)和基因工程類實(shí)驗(yàn)的原理和操作程序。我們以高粱14-3-3 基因家族中的SbGF14c 基因?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料開展本次實(shí)驗(yàn)教學(xué)。預(yù)期本次教學(xué)經(jīng)驗(yàn)可在校內(nèi)及其它高校進(jìn)行推廣。

1 教學(xué)內(nèi)容

本次開放課程的教學(xué)內(nèi)容是“利用原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)外源蛋白SbGF14c”。首先讓同學(xué)查找該蛋白的相關(guān)信息，分析其氨基酸序列、物理化學(xué)特性、蛋白結(jié)構(gòu)等，了解原核表達(dá)技術(shù)的步驟，在老師的幫助下學(xué)生自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)；其次，在原核表達(dá)中，蛋白通常以包涵體的形式存在于沉淀中，如何讓蛋白在細(xì)胞上清中以可溶性形式表達(dá)是原核表達(dá)中面臨的技術(shù)難題。本次實(shí)驗(yàn)學(xué)生通過(guò)自己手動(dòng)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)完成蛋白的原核表達(dá)，得到可溶性表達(dá)蛋白；最后，采用Western blot技術(shù)對(duì)重組蛋白的表達(dá)進(jìn)行鑒定。通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)可加深學(xué)生對(duì)原核表達(dá)方法的理解，同時(shí)鍛煉了學(xué)生的動(dòng)腦思考、獨(dú)立設(shè)計(jì)、動(dòng)手操作、分析結(jié)果和總結(jié)歸納的能力。本次實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容有目的基因的PCR擴(kuò)增、重組載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株、蛋白可溶性表達(dá)條件篩選及重組蛋白鑒定。

表1 教學(xué)內(nèi)容安排

本次教學(xué)共分4 個(gè)小組，3 個(gè)人一組。教學(xué)內(nèi)容安排如表1。

2 教學(xué)效果

在本次開放實(shí)驗(yàn)中，我們把目的基因的克隆、原核表達(dá)載體構(gòu)建、大腸桿菌轉(zhuǎn)化、蛋白可溶性表達(dá)以及蛋白檢測(cè)作為一個(gè)完整的教學(xué)實(shí)驗(yàn)，讓學(xué)生學(xué)習(xí)從目的基因的克隆到蛋白原核表達(dá)及檢測(cè)完整流程。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，用12% SDSPAGE 電泳檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)（不同菌株、溫度、IPTG 濃度），以及用Western blot 進(jìn)一步證實(shí)所表達(dá)的蛋白，讓學(xué)生通過(guò)實(shí)際操作更加直觀的看到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加強(qiáng)了對(duì)蛋白原核表達(dá)技術(shù)（背景、原理、步驟）的理解和掌握，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也激發(fā)了學(xué)生對(duì)蛋白表達(dá)的學(xué)習(xí)興趣，解決學(xué)生心中對(duì)蛋白原核表達(dá)的疑惑。因此，本次實(shí)驗(yàn)教學(xué)是本科生物類專業(yè)中一個(gè)非常值得推廣的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，具體體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

（1）增強(qiáng)學(xué)生對(duì)蛋白序列和原核表達(dá)技術(shù)的理解。本次教學(xué)實(shí)驗(yàn)，讓學(xué)生參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用在線資源自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)步驟并進(jìn)行驗(yàn)證，在此過(guò)程中學(xué)生學(xué)會(huì)了使用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢蛋白序列及蛋白性質(zhì)的相關(guān)信息。在信息高速發(fā)展的今天，本課程結(jié)合生物信息學(xué)基礎(chǔ)，使學(xué)生更加直觀的了解基因和蛋白，這也是本實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的主要目標(biāo)之一。

（2）通過(guò)實(shí)驗(yàn)操作鍛煉學(xué)生的動(dòng)手和分析能力。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需控制菌液濃度OD600=0.5，使細(xì)菌處于最適外源蛋白表達(dá)狀態(tài)，有的同學(xué)對(duì)菌液OD 值把握不準(zhǔn)，需在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行多次探索，積累經(jīng)驗(yàn)；有的同學(xué)在做細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，沒有轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出來(lái)，與小組成員及老師一起探討失敗原因或與實(shí)驗(yàn)成功的同學(xué)交流學(xué)習(xí)，總結(jié)教訓(xùn)；有的同學(xué)在做SDSPAGE 電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)時(shí)，遇到?jīng)]有條帶，與大家共同商討出錯(cuò)原因等等。這些問(wèn)題的解決更加說(shuō)明在本科階段很有必要設(shè)立諸如這類動(dòng)手能力強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)課程，加強(qiáng)學(xué)生的實(shí)際操作能力。

（3）本次實(shí)驗(yàn)教學(xué)適合推廣學(xué)習(xí)。本次實(shí)驗(yàn)教學(xué)屬于分子生物學(xué)、生物化學(xué)范疇。對(duì)于只知理論未進(jìn)行實(shí)際操作的同學(xué)具有實(shí)際意義。對(duì)于生物類專業(yè)的同學(xué)，學(xué)校具備相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，更應(yīng)該開設(shè)該課程。此外，對(duì)于不同的教學(xué)環(huán)境可以根據(jù)自身?xiàng)l件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，希望原核表達(dá)實(shí)驗(yàn)的推廣能夠使更多的學(xué)生受益。

3 教學(xué)總結(jié)

（1）在本次開放實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，將目的基因的克隆、構(gòu)建原核表達(dá)載體、大腸桿菌轉(zhuǎn)化、原核表達(dá)、Western blot 驗(yàn)證原核表達(dá)蛋白，作為較完整的原核表達(dá)的綜合實(shí)驗(yàn)，有利于學(xué)生掌握和理解基因克隆、蛋白表達(dá)及檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和原理。

（2）蛋白表達(dá)和Western blot 是目前生物學(xué)研究中應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)教學(xué)使學(xué)生熟練掌握這些實(shí)驗(yàn)技術(shù)和各種實(shí)驗(yàn)儀器的使用，為將來(lái)從事科學(xué)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

（3）本次教學(xué)中，由于實(shí)驗(yàn)課時(shí)的限制，實(shí)驗(yàn)均在周末進(jìn)行。為達(dá)到更好的教學(xué)效果，教學(xué)要求實(shí)驗(yàn)過(guò)程不僅要高效還要省時(shí)直觀，讓學(xué)生一目了然。此外，今后還需進(jìn)一步增加多樣化教學(xué)方式，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生的積極性，學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中收獲到成就感，興趣和積極性便自然提高，這樣教學(xué)效果、教學(xué)質(zhì)量會(huì)更好。這些是我們今后進(jìn)一步改進(jìn)的方向。

（4）本次教學(xué)為課堂教學(xué)提供了基礎(chǔ)，有利于學(xué)生在課堂教學(xué)后回顧本次實(shí)驗(yàn)教學(xué)，最終達(dá)到融會(huì)貫通。