基于網(wǎng)絡藥理學探討西黃丸治療前列腺癌潛在機制

游旭軍，田雪飛，吳泳蓉，高瑞松，周興，周青，傅偉

基于網(wǎng)絡藥理學探討西黃丸治療前列腺癌潛在機制

游旭軍1，2，田雪飛1，吳泳蓉1，高瑞松1，3，周興3，周青3，傅偉2

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410006；2.深圳市寶安中醫(yī)院（集團），廣東 深圳 518101；3. 湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410011

采用網(wǎng)絡藥理學方法研究西黃丸治療前列腺癌的作用靶點和相關信號通路，進一步分析其治療前列腺癌的理論基礎及潛在機制。應用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）、中藥分子機制的生物信息學分析工具（BATMAN-TCM）獲取西黃丸的活性成分和作用靶點，通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取前列腺癌的疾病靶點，篩選出與西黃丸共同的靶點，利用String構建共同靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡，應用Cytoscape3.7.1軟件構建成西黃丸活性成分-前列腺癌-靶點交集網(wǎng)絡，通過R語言軟件對共同靶點進行GO分析和KEGG通路富集分析，篩選出潛在信號通路并分析其作用機制。共獲得西黃丸生物活性成分27個，通過篩選得到西黃丸作用于前列腺癌的靶點40個，出現(xiàn)頻次較高的有CCND1、EGFR、ESR1、MYC等，主要涉及蛋白體泛素化、蛋白異二聚活性、轉錄因子活性等生物過程，主要富集在PI3K-Akt、MAPK、AGE-RAGE等信號通路。西黃丸治療前列腺癌具有多成分、多靶點、多通路的特點，本研究預測的西黃丸治療前列腺癌機制可為后續(xù)實驗研究提供理論基礎和參考。

網(wǎng)絡藥理學；西黃丸；前列腺癌；作用機制

前列腺癌是常見的男性惡性腫瘤之一。中醫(yī)藥治療前列腺癌尤其是中晚期前列腺癌具有提高患者生活質量、延長生存期等優(yōu)勢[1]。西黃丸是治療早期惡性腫瘤的經(jīng)典名方，由清代醫(yī)家王維德所創(chuàng)，原載于《外科治療匯要》，具有清熱解毒、化痰散結、活血消腫、祛瘀止痛等功效，辨證用于多種類型惡性腫瘤早期的輔助治療。研究表明，西黃丸具有誘導腫瘤細胞凋亡[2]、抑制腫瘤細胞增殖[3]、調節(jié)腫瘤內環(huán)境[4]、增強機體免疫功能[5]等作用，臨床用于乳腺癌、肝癌等可提高患者的生活質量并延長生存時間[6-9]，與內分泌結合治療具有良好的臨床療效[10-12]。

目前西黃丸治療腫瘤的藥效研究仍處于基礎階段，作用靶點及分子機制的研究多為單角度研究，該方治療前列腺癌的機制研究尚未見報道。本研究以網(wǎng)絡藥理學為切入點，探討西黃丸治療早期前列腺癌的有效活性成分和作用靶點，揭示其可能的分子作用靶點和通路，為深入探討其作用機制和藥效物質基礎提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 西黃丸活性成分篩選

應用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及中藥分子機制的生物信息學分析工具（BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）檢索西黃丸方中牛黃、乳香、沒藥、麝香的所有活性成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件進行篩選，得到西黃丸的生物活性成分。

1.2 活性成分-靶點網(wǎng)絡構建

應用TCMSP和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索西黃丸所有活性成分的靶基因，通過Cytoscape3.7.1軟件（https://cytoscape.org/）構建活性成分-靶點網(wǎng)絡，以探究西黃丸的藥理學作用機制。

1.3 前列腺癌疾病靶點篩選

通過GeneCards（https://www.genecards.org/）和OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/），設置檢索詞為“prostate cancer”，檢索前列腺癌的疾病靶點，并應用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）對疾病靶點進行標準化，獲得Swiss-Prot ID。

1.4 活性成分與疾病共同靶點篩選及蛋白相互作用網(wǎng)絡構建

明確前列腺癌相關靶點與西黃丸潛在靶點之間的相互作用，應用R語言（https://www.r-project.org/）軟件及Perl語言程序將疾病靶點與藥物靶點取交集。應用String（https://string-db.org/）數(shù)據(jù)平臺構建共同靶點蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡，將蛋白種類設置為“Homo sapiens”，將Settings設為“high confidence：0.7”，其他參數(shù)保持默認設置，獲得PPI網(wǎng)絡。應用count.R插件獲得共同蛋白靶點出現(xiàn)的頻次。

1.5 活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡構建

應用Cytoscape3.7.1軟件的merge功能構建活性成分-疾病靶點網(wǎng)絡。網(wǎng)絡圖中“node”代表活性成分和靶點，“edge”代表活性成分-前列腺癌-靶點之間的相互關系。基于構建的網(wǎng)絡探討西黃丸治療前列腺癌的潛在機制。

1.6 GO分析和KEGG通路富集分析

應用R語言（https://www.r-project.org/）軟件中clusterProfilerGO.R插件及Perl語言對西黃丸活性成分與前列腺癌的共同靶點進行GO分析，GO分析主要用于描述基因產物的功能，包括細胞組分、分子功能和生物過程。并應用clusterProfilerKEGG.R插件進行KEGG通路富集分析。根據(jù)富集因子值分析富集程度，探究西黃丸治療前列腺癌可能的生物功能及信號通路機制。

2 結果

2.1 西黃丸活性成分

通過TCMSP、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫對西黃丸組成藥物已報道的活性成分進行檢索，并以OB≥30%和DL≥0.18為條件進行篩選，去掉重復成分后得到27個生物活性成分，結果見表1。

2.2 活性成分-靶點網(wǎng)絡

西黃丸27個生物活性成分的不重復作用靶點共206個，構建活性成分-靶點網(wǎng)絡。degree值高的活性成分有可能在西黃丸的藥理功能中發(fā)揮著較為重要的作用，居前3位的成分分別為槲皮素（quercetin，degree＝77）、β-谷甾醇（beta-sitosterol，degree＝16）、豆甾醇（Stigmasterol，degree＝13）。

表1 西黃丸的主要活性成分

分子編號活性成分OB/%DL MOL001002ellagic acid43.060.43 MOL001004pelargonidin37.990.21 MOL001006poriferasta-7,22E-dien-3beta-ol42.980.76 MOL001026myrrhanol C39.960.58 MOL001028(8R)-3-oxo-8-hydroxy-polypoda-13E,17E,21- triene44.830.59 MOL001029myrrhanones B34.390.67 MOL001031epimansumbinol61.810.40 MOL001033Diayangambin63.840.81 MOL001040(2R)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl) chroman-4-one42.360.21 MOL001045(13E,17E,21E)-8-hydroxypolypodo-13,17, 21-trien-3-one44.340.58 MOL001061(16S, 20R)-dihydroxydammar-24-en-3-one37.340.78 MOL00106215α-hydroxymansumbinone37.510.44 MOL00106328-acetoxy-15α-hydroxymansumbinone41.850.67 MOL001095isofouquierone40.950.78 MOL001126[(5aS,8aR,9R)-8-oxo-9-(3,4,5-trimethoxyphenyl)- 5,5a,6,9-tetrahydroisobenzofurano[6,5-f][1,3] benzodioxol-8a-yl] acetate44.080.90 MOL001131phellamurin_qt56.600.39 MOL0011563-methoxyfuranoguaia-9-en-8-one35.150.18 MOL001175Guggulsterone42.450.44 MOL000358beta-sitosterol36.910.75 MOL000449Stigmasterol43.830.76 MOL000490petunidin30.050.31 MOL000098quercetin46.430.28 MOL008839Methyl desoxycholate34.630.73 MOL008845Deoxycholic Acid40.720.68 MOL008846ZINC0128036546.380.49 MOL000953CLR37.870.68 MOL001295phyllocladene33.400.27

2.3 前列腺癌疾病靶點

通過檢索GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫并設置Relevance score≥17.0篩選，刪去重復靶點，共得到485個前列腺癌的疾病治療靶點。

2.4 共同靶點及蛋白相互作用網(wǎng)絡

將485個前列腺癌疾病治療靶點與藥物活性成分作用靶點85個（含重復）應用R語言軟件及Perl語言程序共篩選出40個共同靶點，輸入String數(shù)據(jù)平臺，在“high confidence：0.7”模式下構建PPI網(wǎng)絡，見圖1。應用count.R插件統(tǒng)計出現(xiàn)頻次居前30位的蛋白靶點，出現(xiàn)頻次較高的有CCND1、EGFR、ESR1、MYC等，可作為西黃丸治療前列腺癌的潛在靶點，見圖2。

圖1 西黃丸治療前列腺癌藥物活性成分-疾病共同靶點PPI網(wǎng)絡

圖2 西黃丸治療前列腺癌藥物活性成分-疾病共同蛋白靶點出現(xiàn)頻次（前30位）

2.5 活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡

采用Cytoscape3.7.1軟件在活性成分-疾病-靶點網(wǎng)絡中獲得69個節(jié)點（靶點40個，活性成分27個，疾病和藥物各1個）和147條邊，見圖3。

2.6 西黃丸治療前列腺癌GO分析及核心通路篩選

共同靶點GO分析柱狀圖和氣泡圖見圖4。其中，生物過程主要涉及蛋白體泛素化、蛋白異二聚活性、轉錄因子活性等。這體現(xiàn)了西黃丸可能通過調控多個復雜的生物過程治療前列腺癌。靶點KEGG通路富集分析結果見圖5，節(jié)點大小表示富集的靶點數(shù)量，節(jié)點顏色由紅色至深藍色表示值由小到大，因此紅色節(jié)點越大表示信號通路的顯著性越高，該條信號通路越重要。排除廣泛通路后，富集靶點數(shù)目≥5的信號通路見表2。通過分析，40個共同靶點主要分布在PI3K-Akt、MAPK、AGE-RAGE、HIF-1、Estrogen等多條信號通路中，提示西黃丸通過作用于多條信號通路治療前列腺癌。以PI3K-Akt信號通路為例，西黃丸治療前列腺癌的潛在靶點和作用機制見圖6。

注：紅色代表西黃丸，淡藍色代表前列腺癌，藍色代表西黃丸活性成分，綠色代表西黃丸活性成分與前列腺癌共同靶點

圖4 西黃丸治療前列腺癌靶點GO分析

圖5 西黃丸治療前列腺癌靶點KEGG富集分析

表2 西黃丸治療前列腺癌KEGG富集靶點數(shù)目≥5的信號通路

ID號信號通路基因數(shù)量基因 hsa04151PI3K-Akt signaling pathway13RELA，VEGFA，IGF2，BCL2，CASP9，GSK3B，EGFR，CCND1，IL6，RAF1，ERBB2，MYC，NOS3 hsa04010MAPK signaling pathway9RELA，VEGFA，IGF2，CASP3，EGFR，RAF1，ERBB2，MYC，HSPB1 hsa04933AGE-RAGE signaling pathway indiabetic complications8RELA，VEGFA，BCL2，CASP3，CCND1，IL6，ICAM1，NOS3 hsa04066HIF-1 signaling pathway8RELA，VEGFA，BCL2，EGFR，IL6，HIF1A，ERBB2，NOS3 hsa04915Estrogen signaling pathway8ESR1，PGR，BCL2，ESR2，EGFR，RAF1，NOS3，CTSD hsa04115p53 signaling pathway7BCL2，CASP9，CASP3，CASP8，CCND1，CCNB1，CHEK2 hsa04919Thyroid hormone signaling pathway7ESR1，CASP9，GSK3B，CCND1，RAF1，HIF1A，MYC hsa04917Prolactin signaling pathway6ESR1，RELA，ESR2，GSK3B，CCND1，RAF1 hsa04657IL-17 signaling pathway6RELA，NFKBIA，CASP3，CASP8，GSK3B，IL6 hsa04064NF-kappa B signaling pathway6RELA，NFKBIA，BCL2，PLAU，ICAM1，PARP1 hsa04668TNF signaling pathway6RELA，NFKBIA，CASP3，CASP8，IL6，ICAM1 hsa04926Relaxin signaling pathway6RELA，VEGFA，NFKBIA，EGFR，RAF1，NOS3 hsa04630JAK-STAT signaling pathway6BCL2，EGFR，CCND1，IL6，RAF1，MYC hsa04014Ras signaling pathway6RELA，VEGFA，IGF2，EGFR，RAF1，RASSF1 hsa04370VEGF signaling pathway5VEGFA，CASP9，RAF1，NOS3，HSPB1 hsa04012ErbB signaling pathway5GSK3B，EGFR，RAF1，ERBB2，MYC hsa05235PD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancer5RELA，NFKBIA，EGFR，RAF1，HIF1A hsa04625C-type lectin receptor signaling pathway5RELA，NFKBIA，CASP8，IL6，RAF1 hsa04071Sphingolipid signaling pathway5RELA，BCL2，RAF1，NOS3，CTSD hsa04722Neurotrophin signaling pathway5RELA，NFKBIA，BCL2，GSK3B，RAF1 hsa04068FoxO signaling pathway5EGFR，CCND1，IL6，RAF1，CCNB1 hsa04390Hippo signaling pathway5GSK3B，CCND1，MYC，BIRC5，RASSF1 hsa04621NOD-like receptor signaling pathway5RELA，NFKBIA，BCL2，CASP8，IL6

注：紅色節(jié)點代表西黃丸作用的潛在靶點及與潛在靶點相關的酶和化合物

3 討論

前列腺癌屬中醫(yī)學“積聚”“血淋”范疇，其病理因素以痰、瘀、毒為主，治法常以抗癌解毒、活血消癥為主[13]。對于早期前列腺癌患者，臨床常在單純內分泌治療的基礎上運用活血化瘀通竅法。西黃丸由麝香、牛黃、乳香、沒藥組成，方中牛黃能清心火、解熱毒、豁痰、開竅；麝香芳香走竅，能通經(jīng)絡、散瘀消腫、破積聚；乳香與沒藥相互配合，活血化瘀、消腫定痛。全方共奏活血化瘀通竅、攻毒軟堅消積作用，臨床用于早期腫瘤的治療。

本研究從網(wǎng)絡藥理學入手，初步挖掘、探討西黃丸治療前列腺癌的作用機制，為西黃丸多成分、多靶點、多通路的治療機制提供參考。本研究檢索數(shù)據(jù)庫并篩選得到西黃丸的27個生物活性成分，通過活性成分-靶點網(wǎng)絡構建得知關鍵活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等。研究顯示，槲皮素可能通過靶向調控核因子-κB相關信號通路而發(fā)揮對口腔黏膜鱗狀細胞癌的化學預防作用[14]；通過抑制Wnt/β-catenin信號通路活化，抑制宮頸癌細胞的增殖和遷移[15]；抑制Siha細胞生長、增殖、遷移和侵襲并靶向調控miR-23b/MAPK1軸[16]；還能抑制人乳腺癌細胞株T47D的增殖、促進其凋亡[17]；通過誘導p53非依賴性G2/M細胞周期阻滯和細胞凋亡，實現(xiàn)對腫瘤細胞增殖的抑制作用[18]。β-谷甾醇通過PI3K/AKT/mTOR通路誘導細胞自噬，抑制胃癌細胞增殖并促進其凋亡[19]；對H22荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用，其機制可能與對白細胞介素-6、干擾素-γ和血管內皮生長因子（VEGF）表達的調節(jié)有關[20]；可誘導人肺腺癌A549細胞G2/M期細胞周期阻滯，并引起細胞凋亡性死亡[21]；能有效誘導腔鱗狀細胞癌SCC9細胞凋亡[22]。豆甾醇具有抑制人肝癌細胞SMMC-7721的增殖和誘導細胞凋亡的作用[23]?？傊?，西黃丸的主要活性成分可通過相關信號通路抑制腫瘤細胞的生長或促進其凋亡。

對西黃丸與前列腺癌的共同靶點進行PPI映射并構建活性成分-前列腺癌-靶點網(wǎng)絡，對網(wǎng)絡進行分析后發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)頻次較高的關鍵靶點有CCND1、EGFR、ESR1、MYC、VEGFA、CASP3、AR、IL6等，可作為西黃丸治療前列腺癌的潛在靶點。CCND1是一種原癌基因[24]，其過度表達可致細胞增殖失控而惡性化，在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了CCND1基因過表達和基因擴增等[25]。研究表明，在許多實體腫瘤中存在表皮生長因子受體（EGFR）的高表達或異常表達[26]，EGFR與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑制有關[27-28]；此外，對EGFR與腫瘤的血管生成、高侵襲性及轉移關系的研究發(fā)現(xiàn)，EGFR可以通過對血管內皮生長因子等水平的調節(jié)而影響腫瘤血管生成[29]。MYC基因擴增與腫瘤的關系研究認為，胃癌、乳腺癌、結腸癌、宮頸癌及頭部腫瘤等都有MYC基因的擴增或過度表達[30-31]。此外，血管內皮生長因子A（VEGFA）與腫瘤侵染性相關，CASP3基因多態(tài)性與前列腺癌風險呈正相關[32]。本研究通過GO分析和KEGG核心通路篩選明確共同靶點在前列腺癌治療中的生物學作用及信號通路。其中生物過程主要涉及蛋白體泛素化、蛋白異二聚活性、轉錄因子活性、RNA調控、核受體調節(jié)、細胞凋亡等，表明西黃丸可能通過調控多個復雜的生物過程治療前列腺癌?；蚋患治霰砻?，40個共同靶點主要富集到與癌癥相關的通路上，包括前列腺癌通路、蛋白聚糖癌癥通路、MiRNAs通路、乳腺癌通路、大腸癌通路等，其主要調控通路有PI3K-Akt、MAPK、AGE-RAGE、HIF-1、Estrogen、p53等，表明西黃丸通過作用于多條信號通路治療前列腺癌。

研究表明，西黃丸可上調MEKK1、SEK1mRNA和蛋白而誘導腫瘤細胞凋亡[33]，作用于STAT3信號通路抑制腫瘤細胞增殖[3]，作用于Akt/mTOR/FOXO1通路調節(jié)腫瘤內環(huán)境[4]，降低外周血白細胞介素-17、白細胞介素-6水平而有效調節(jié)機體免疫功能等[5]。另外，根據(jù)KEGG富集分析結果推斷，西黃丸的生物有效成分可能通過作用于與癌癥直接相關的通路，從而對多種癌癥起到治療作用，并減輕放化療術后不良反應，與臨床報道[5-12]相符。PI3K-Akt信號通路共富集13個靶基因，與相關研究報道[4]基本一致，顯示KEGG富集結果具有可靠性。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學探討西黃丸治療前列腺癌的作用機制，結果顯示西黃丸中27個生物活性成分通過調控40個靶點、主要參與PI3K-Akt等信號通路作用于前列腺癌，揭示了西黃丸可能的分子作用通路及機制，可為深入探討其藥效物質基礎提供可靠的理論依據(jù)。

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Discussion on Potential Mechanism ofPills in Treatment of Prostate Cancer Based on Network Pharmacology

YOU Xujun1,2, TIAN Xuefei1, WU Yongrong1, GAO Ruisong1,3, ZHOU Xing3, ZHOU Qing3, FU Wei2

To study the therapeutic targets and related signaling pathways ofPills in the treatment of prostate cancer by network pharmacology; To further analyze the theoretical basis and potential mechanism for the treatment of prostate cancer.The active ingredients and targets ofPills were obtained by using Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP) and Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine (BATMAN-TCM). The targets of prostate cancer were obtained through GeneCards and OMIM database; the common targets withPills were screen out. String was used to build a common target protein interaction network. Cytoscape 3.7.1 software was used to construct a network of active ingredients ofPills -prostate cancer -target intersection. GO analysis and KEGG analysis were conducted for common targets through R language software, the potential pathways were screened out, and their mechanism of action were analyzed.A total of 27 bioactive components were obtained fromPills, and 40 common targets ofPills for prostate cancer were obtained by screening intersection. The most frequent occurrences were CCND1, EGFR, ESR1, MYC, etc. These targets were mainly involved in biological processes, such as ubiquitination, protein heterodimerization, and transcription factor activity, and were mainly concentrated in PI3K-Akt, MAPK, AGE-RAGE and other signaling pathways.Pills treats prostate cancer has characteristics of multi-component, multi-target and multi-pathway. The predicted mechanism ofPills in the treatment of prostate cancer can provide a reliable theoretical basis and reference for subsequent experimental research.

network pharmacology;Pills; prostate cancer; mechanism

R273.72；R285.5

A

1005-5304(2020)10-0092-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.201910428

國家自然科學基金（81573988）；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)男科重點學科（2012年）；湖南省科技計劃項目（2015JC3075）；湖南省高層次衛(wèi)生人才“225”工程培養(yǎng)項目（2019年）；深圳市科技計劃項目（JCYJ20180302144752020）

周青，E-mail：supergoon@163.com

（2019-10-28）

（2019-11-21；編輯：陳靜）