龍須藤總黃酮對(duì)糖尿病大鼠腎臟中NF-κB信號(hào)通路的影響

李加林，張嘉文，何凱倫，林建梭，吳素珍

（1.贛南醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室；2.贛南醫(yī)學(xué)院2019級(jí)碩士研究生；3.贛南醫(yī)學(xué)院2013級(jí)本科生；4.贛南醫(yī)學(xué)院2014級(jí)本科生；5.贛南醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，江西贛州341000）

糖尿病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)有逐漸上升的趨勢(shì)，根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（IDF）2019年的最新報(bào)告，目前全球糖尿病患者（20～79歲）約為4.63億［1］。糖尿病是一種以血糖升高為特點(diǎn)的慢性代謝性疾病，糖尿病時(shí)伴有的長(zhǎng)期高血糖將導(dǎo)致很多慢性并發(fā)癥的產(chǎn)生，如糖尿病腎臟疾病（Diabetic kidney disease，DKD）、糖尿病眼病、糖尿病心血管疾病等，其中糖尿病腎病是糖尿病發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)的常見(jiàn)而難治的微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎臟疾病的主要因素［2-3］。

糖尿病是一種炎癥性疾病，文獻(xiàn)研究表明糖尿病時(shí)高血糖可誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)如TNF-α、IL-6、IL-1β從而引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)［4］。NF-κB信號(hào)系統(tǒng)是重要的炎癥信號(hào)系統(tǒng)。NF-κB是一種在細(xì)胞漿中廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，p65-p50二聚體是其主要的存在形式。NF-κB通過(guò)與抑制性蛋白IκBα結(jié)合從而以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞漿中，外界因素導(dǎo)致IκBα磷酸化和泛素化，繼而被降解，NF-κB脫離了IκBα的阻滯，可轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，p65的核轉(zhuǎn)位是NF-κB信號(hào)通路活化的重要標(biāo)志［5］。

龍須藤（Bauhinia Championi）為豆科羊蹄甲屬木質(zhì)藤本植物，贛南地區(qū)分布廣，資源豐富，贛南民間用來(lái)治療炎癥性疾病，如腸炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。文獻(xiàn)報(bào)道龍須藤有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗感染、抗血小板凝集等作用［6-8］，大量研究表明龍須藤乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位是龍須藤抗炎鎮(zhèn)痛、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的有效部位［9-10］，但尚未見(jiàn)有龍須藤治療糖尿病腎臟疾病的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑雄性SD大鼠，體質(zhì)量為200～250 g，購(gòu)于贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（贛）2014-0001。龍須藤總黃酮（實(shí)驗(yàn)室自制，總黃酮含 量65.0%），SP試 劑 盒（Solarbio），p65抗 體（Abcam），RIPA裂解液（Solarbio），F(xiàn)ITC標(biāo)記的驢抗山羊IgG、DAPI（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 龍須藤總黃酮的提取取干燥粉碎的龍須藤莖，按藥材與提取溶劑比例為1∶10（g·mL-1），加入10倍量70%乙醇，回流提取3次，每次2 h，合并提取液，抽濾，減壓回收乙醇至無(wú)醇味，得到龍須藤的乙醇浸膏。將浸膏用水分散后用乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取液減壓回收乙酸乙酯，得到乙酸乙酯萃取浸膏。取乙酸乙酯浸膏適量作為上樣樣品，進(jìn)行硅膠柱層析分離。采用溶劑系統(tǒng)為二氯甲烷/乙酸乙酯（8∶1～4∶1），梯度洗脫，TLC跟蹤分析，合并相同部位，得到龍須藤總黃酮。

1.2.2 動(dòng)物模型的建立大鼠禁食不禁水12 h，然后腹腔注射55 mg·kg-1鏈脲佐菌素（STZ，Sigma Chemicals Co.，Ltd.，USA），STZ溶解在pH 4.2～4.5 的檸檬酸鈉緩沖液中，正常對(duì)照組則注射等體積檸檬酸鈉緩沖液，注射STZ 72 h后隨機(jī)血糖＞16.7 mmol·L-1則判斷為糖尿病模型造模成功。然后將大鼠分為三組，對(duì)照組：非糖尿病大鼠灌胃等體積生理鹽水；糖尿?。―M）組：糖尿病大鼠灌胃等體積生理鹽水；龍須藤治療組：糖尿病大鼠灌胃80 mg·kg-1龍須藤總黃酮。

1.2.3 免疫組化免疫組化采用SP試劑盒，包括：過(guò)氧化物酶阻斷液（試劑A）、非免疫性動(dòng)物血清（試劑B）、生物素標(biāo)記的二抗（試劑C）、鏈親和素-過(guò)氧化物酶溶液（試劑D）；DAB試劑盒，包括：DAB緩沖液20×（試劑A）、DAB底物20×（試劑B）、DAB色原20×（試劑C）。免疫組化操作步驟如下：

（1）將石蠟切片置于二甲苯脫蠟2×10 min。（2）將切片浸于100%酒精、95%酒精、80%酒精、70%酒精進(jìn)行梯度水化，再用0.01 M PBS漂洗3次。（3）切片放入0.01 M檸檬酸抗原修復(fù)液中，用微波進(jìn)行抗原修復(fù)。（4）室溫冷卻后，0.01M PBS漂洗3次。（5）滴加“試劑A”，置于37℃濕盒中孵育10 min。（6）0.01 M PBS漂洗3次。（7）滴加“試劑B”，置于37℃濕盒中孵育10 min。（8）甩去多余“試劑B”，滴加一抗，置于濕盒中4℃孵育過(guò)夜，0.01 M PBS漂洗3次。（9）滴加“試劑C”，置于濕盒中37℃孵育15 min，0.01 M PBS漂洗3次。（10）滴加“試劑D”，置于濕盒中37℃孵育15 min，甩去多余液體。（11）滴加新配制的DAB顯色液，光鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，自來(lái)水充分沖洗以終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，之后放入鹽酸酒精分色，快速拿出，浸沒(méi)時(shí)間在1～2 s內(nèi)。配制DAB顯色液：在小試管中先加入0.85 mL去離子水，再按試劑A、B、C順序加入試劑各50μL，混勻即成1 mL DAB顯色液，若有沉淀可過(guò)濾后使用，30 min內(nèi)有效。（12）將切片順序浸于70%酒精、80%酒精、95%酒精、100%酒精、二甲苯梯度脫水透明，中性樹(shù)膠封片，于光鏡下觀察。

1.2.4 免疫熒光大鼠腎皮質(zhì)經(jīng)石蠟包埋后切片，經(jīng)脫蠟、梯度酒精脫水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，然后用0.01 M PBS漂洗3次；2% BSA 37℃濕盒內(nèi)封閉30 min；滴加適當(dāng)稀釋的特異性抗體，放在濕盒中，37℃孵育30 min，0.01 M PBS漂洗3次；FITC標(biāo)記的二抗抗體37℃避光孵育30 min，0.01M PBS避光漂洗3次；DAPI染核，37℃孵育5～10 min，PBS漂洗3次；抗熒光淬滅劑封片后于熒光顯微鏡下觀察，每個(gè)樣本隨機(jī)取3個(gè)視野拍片觀察。

1.2.5 細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的分離及檢測(cè)細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的提取與分離按試劑盒說(shuō)明書操作。采用SDS-PAGE（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis）分離樣品中的蛋白成分。再將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到0.45μm硝酸纖維素膜（NC膜）上，NC膜先進(jìn)行封閉，與各自不同濃度的一抗進(jìn)行孵育4℃過(guò)夜，洗滌后再與過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育，再次洗滌，電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）檢測(cè)免疫印跡信號(hào)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)給予龍須藤總黃酮治療后糖尿病大鼠腎臟中p65在胞漿與胞核中的分布情況首先建立STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠動(dòng)物模型，然后采用龍須藤總黃酮（80 mg·kg-1）灌胃糖尿病大鼠3個(gè)月后，收集大鼠腎皮質(zhì)。用抗p65的抗體進(jìn)行免疫組化與免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示給予龍須藤總黃酮治療糖尿病大鼠3個(gè)月后，p65的核轉(zhuǎn)位明顯比糖尿病組少，這說(shuō)明龍須藤總黃酮能夠抑制糖尿病大鼠腎臟中NF-κB信號(hào)的激活，如圖1所示。

圖1免疫組化檢測(cè)給予龍須藤總黃酮治療后糖尿病大鼠腎臟p65在胞漿與胞核中的分布情況（200×）

2.2 免疫熒光檢測(cè)給予龍須藤總黃酮治療后糖尿病大鼠腎臟中p65在胞漿與胞核中的分布情況建立STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型，然后采用龍須藤總黃酮灌胃糖尿病大鼠3個(gè)月后，收集大鼠腎皮質(zhì)。用FITC標(biāo)記的二抗（綠色）識(shí)別p65抗體進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中p65在細(xì)胞漿與細(xì)胞核中的分布情況，用DAPI染細(xì)胞核（藍(lán)色），結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠腎皮質(zhì)中被綠色熒光和藍(lán)色熒光共同標(biāo)記的細(xì)胞核明顯比龍須藤總黃酮治療組高，這表明龍須藤能夠抑制糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中p65的核轉(zhuǎn)位，對(duì)糖尿病大鼠腎臟中NF-κB信號(hào)通路具有抑制作用，結(jié)果如圖2所示。

2.3 分離大鼠腎皮質(zhì)，提取細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白，免疫印跡檢測(cè)p65在細(xì)胞漿與細(xì)胞核中的分布情況建立STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型，然后采用龍須藤總黃酮灌胃糖尿病大鼠3個(gè)月后，收集大鼠腎皮質(zhì)。然后按照試劑盒所述方法分離細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白，采用Western blot的方法檢測(cè)糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中p65在細(xì)胞漿與細(xì)胞核中的分布情況。結(jié)果表明，糖尿病組大鼠腎皮質(zhì)中p65在胞核中的分布多于胞漿，而給予龍須藤總黃酮治療后，p65在胞漿中的分布多于胞核（圖3），這一結(jié)果再次證明了龍須藤總黃酮能夠抑制STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟中NF-κB信號(hào)通路的激活。

圖2免疫熒光檢測(cè)大鼠腎皮質(zhì)中p65在細(xì)胞漿與細(xì)胞核中的分布情況（400×）

圖3分離大鼠腎皮質(zhì)，提取細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白，免疫印跡檢測(cè)p65在細(xì)胞漿與細(xì)胞核中的分布情況

3 討論

糖尿病腎病是一種炎癥性疾病，而抑制炎癥反應(yīng)可以有效延緩糖尿病腎病的進(jìn)程。核因子-KappaB（Nuclear factor-KappaB，NF-κB）的活化在炎癥反應(yīng)起始及發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用，在許多腎臟類疾病中NF-κB信號(hào)通路是激活的。有研究表明，NF-κB信號(hào)通路在糖尿病腎臟疾病的發(fā)展過(guò)程中起著不可忽視的作用。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的炎癥信號(hào)通路來(lái)改善糖尿病腎臟疾病引起了科學(xué)家們的極大興趣［11］。炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎性細(xì)胞因子如IL-6和TNF-α的分泌已被證明與糖尿病腎臟疾病有關(guān)［12-14］。

NF-κB信號(hào)系統(tǒng)是重要的炎癥信號(hào)系統(tǒng)，NF-κB的過(guò)度激活會(huì)引起很多疾病。NF-κB是一種在細(xì)胞漿中廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，p65-p50二聚體是其主要的存在形式。NF-κB通過(guò)與抑制性蛋白IκBα結(jié)合從而以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞漿中，外界因素導(dǎo)致IκBα磷酸化和泛素化，繼而被降解，NF-κB脫離了IκBα的阻滯，可轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，p65的核轉(zhuǎn)位是NF-κB信號(hào)通路活化的重要標(biāo)志［15-17］。免疫組化和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎皮質(zhì)細(xì)胞中發(fā)生了p65的核轉(zhuǎn)位，而龍須藤治療組p65的核轉(zhuǎn)位與糖尿病組比明顯減少，這說(shuō)明糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中NF-κB信號(hào)通路是激活的，而龍須藤總黃酮能夠抑制糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中NF-κB信號(hào)通路的激活。然而，龍須藤總黃酮畢竟是混合物，具體發(fā)揮作用的成分還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

龍須藤總黃酮能夠通過(guò)抑制糖尿病大鼠腎皮質(zhì)中NF-κB信號(hào)通路的激活從而改善糖尿病腎臟疾病。