生物合成脂肽的研究進展及展望

馬天祥

（中國石油大慶煉化公司研究院，黑龍江大慶163411）

大慶油田的3次采油技術(shù)在國內(nèi)處于領(lǐng)先地位，繼聚合物驅(qū)油和化學(xué)三元復(fù)合驅(qū)油后，無堿二元復(fù)合驅(qū)油和微生物驅(qū)油技術(shù)等已經(jīng)提上日程，其中生物表面活性劑驅(qū)油有重要的應(yīng)用前景。

1 脂肽類表面活性劑研究現(xiàn)狀

在石油開采領(lǐng)域，最受關(guān)注的生物表面活性劑是以表面活性素為代表的脂肽家族。1968年Arima等［1］首次發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌株（Bacillussubtilis）產(chǎn)生的是脂肽類表面活性劑。

脂肽分子由親水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分組成，由于特殊的化學(xué)組成和兩親型分子結(jié)構(gòu)，使其成為具有高表面活性和穩(wěn)定性的生物表面活性劑。其提高原油采收率機理在于能夠降低表界面張力，降低毛細管力，有利于原油流動，從而提高石油開采量［2］。典型的表面活性素分子的氨基酸序列結(jié)構(gòu)見圖1，分子結(jié)構(gòu)見圖2。

圖1表面活性素分子氨基酸序列

圖2表面活性素分子結(jié)構(gòu)式

包括疏水端的脂肪酸鏈和親水端的環(huán)狀寡肽，即由12～16個碳鏈長度的脂肪酸與7個氨基酸形成的肽環(huán)構(gòu)成，其末端氨基酸的羧基與脂肪酸鏈的β-羥基縮合形成內(nèi)脂結(jié)構(gòu)［3，4］，其主要生產(chǎn)菌株是枯草芽孢桿菌和假單胞菌。

在成本方面，由于脂肽結(jié)構(gòu)和合成機制復(fù)雜，天然合成效率不高。野生菌脂肽產(chǎn)量約1 g/L，當脂肽產(chǎn)量為20 g/L時，其生產(chǎn)成本就可以與目前廣泛應(yīng)用的石油磺酸鹽相當。

如果表面活性素的用量僅為石油磺酸鹽的20%～10%時，則表面活性素的使用成本將降得更低，可以從根本上解決成本問題。

2 表面活性素合成菌株的小試和中試培養(yǎng)

2.1 清華大學(xué)技術(shù)研發(fā)

清華大學(xué)化工系10多年前開始脂肽生產(chǎn)菌株改造及其發(fā)酵生產(chǎn)工藝研究。通過對合成表面活性素的枯草芽孢桿菌細胞工廠的跨膜通道、強啟動合成、氨基酸前體途徑、脂肪酸前體途徑以及芽孢合成途徑進行基因調(diào)控改造，目前獲得的重組枯草芽孢桿菌的表面活性素產(chǎn)量已經(jīng)可達20 g/L以上，是公開報道的最好水平。

基于與清華大學(xué)化工系合作進行的生物表面活性素產(chǎn)業(yè)化技術(shù)開發(fā)，首先利用清華大學(xué)前期已經(jīng)對產(chǎn)表面活性素野生菌株B.subtilis THY-7以及高產(chǎn)基因工程菌B.subtilis TS1726Y的發(fā)酵培養(yǎng)基（碳源、氮源、碳氮比、微量元素）及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化基礎(chǔ)上，通過搖瓶發(fā)酵優(yōu)化確認了基因工程菌B.subtilis TS1726Y的優(yōu)化培養(yǎng)條件及其在優(yōu)化條件下的搖瓶產(chǎn)量，對產(chǎn)物進行了高壓液相色譜分析和鑒定。

進一步在30 L發(fā)酵罐的小規(guī)模中試發(fā)酵水平上對基因工程菌B.subtilis TS1726Y的發(fā)酵培養(yǎng)進行了考察，確定了合適的發(fā)酵模式和攪拌轉(zhuǎn)速。

2.2 表面活性素合成菌株的搖瓶實驗

首先在搖瓶中進行了對誘導(dǎo)劑、氨基酸、豆油前體等培養(yǎng)基配方的優(yōu)化驗證，確認了高產(chǎn)表面活性素的基因工程菌B.subtilis TS1726Y的優(yōu)選培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，配方見文獻［5］。

采用優(yōu)化方案后進行菌株發(fā)酵培養(yǎng)時，發(fā)酵時間由60 h縮短至48 h且產(chǎn)物最高產(chǎn)量達26 g/L，與優(yōu)化前的13.6 g/L相比，表面活性素產(chǎn)量提高了近1倍。針對配方中用量最大、對表面活性素產(chǎn)量影響較大的紅糖,選擇市場上4個品牌進行試驗,篩選出使用北京某品牌產(chǎn)量最高。表面活性素含量測定方面,在利用清華大學(xué)提供的液相色譜法的同時，嘗試了用酸沉法測定，結(jié)果表明2者差別不大,均可用于含量測定。

采用高壓液相色譜對產(chǎn)出的表面活性素進行了鑒定，4種主要產(chǎn)物的脂肪酸鏈長度分別為C13、C14、C14以及C15，見圖3。

基因工程菌B.subtilis TS1726Y合成的表面活性素產(chǎn)品由4種主要產(chǎn)物構(gòu)成，清華大學(xué)合作者通過串聯(lián)質(zhì)譜分析，進一步證明這4種產(chǎn)物中的脂肪酸鏈長度分別為C13、C14、C14以及C15，其7種氨基酸組成分別為Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu或Glu-Val-Leu-Leu-Asp-Leu-Val。

圖3搖瓶表面活性素液相色譜

3 發(fā)酵罐中試實驗

3.1 不同發(fā)酵模式對比

由于脂肽類表面活性劑的特殊性質(zhì)，在搖瓶水平時較易生產(chǎn)，但放大至發(fā)酵罐水平時由于通氣和攪拌的存在極易產(chǎn)生大量泡沫，導(dǎo)致發(fā)酵過程無法順利進行?，F(xiàn)階段脂肽發(fā)酵模式主要有外源添加消泡劑、直接排泡、泡沫回流等方式。對各方式發(fā)酵周期及OD600進行對比，結(jié)果見圖4。

圖4不同發(fā)酵模式OD600變化對比

發(fā)酵過程添加消泡劑是常規(guī)發(fā)酵中抑制泡沫的有效方法，常規(guī)發(fā)酵中所用到的消泡劑主要有硅類、天然油脂、聚醚類、高碳醇和聚醚改性硅類等，但有機硅及聚醚類消泡劑在添加量過多后均會對菌體生長造成一定抑制作用，大豆油作為碳源促進菌體生長代謝并提高脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量，因此嘗試選擇大豆油作為脂肽發(fā)酵過程中所用消泡劑。實驗過程發(fā)現(xiàn)，豆油作為消泡劑一定程度上可以消除前期培養(yǎng)基內(nèi)蛋白質(zhì)類物質(zhì)所產(chǎn)生的泡沫，但對產(chǎn)物引起的泡沫抑制能力有限，需持續(xù)添加，至發(fā)酵中后期豆油對脂肽所產(chǎn)生的泡沫完全無抑制作用，發(fā)酵周期僅維持約28 h。由于脂肽是1種較好的乳化劑，在發(fā)酵液中添加豆油后由于攪拌及通氣作用，很容易使發(fā)酵液與豆油之間發(fā)生乳化反應(yīng)形成穩(wěn)定的水包油狀態(tài)，該狀態(tài)在發(fā)酵結(jié)束后很難消除，對后期檢測及提取造成困難。且由于乳化現(xiàn)象的存在使發(fā)酵液OD600持續(xù)增加直至結(jié)束時達到50，對觀察發(fā)酵周期內(nèi)菌體生長情況造成阻礙。

脂肽發(fā)酵過程中泡沫產(chǎn)生比較劇烈，若直接將泡沫排出收集，同時會帶走大量培養(yǎng)基，導(dǎo)致罐內(nèi)發(fā)酵液損失嚴重，發(fā)酵16 h后發(fā)酵液損失約一半，在28 h時，10 L體積的培養(yǎng)基剩余量僅為1 L，致使發(fā)酵無法繼續(xù)進行，同時發(fā)酵液的損失導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)不能被充分利用，營養(yǎng)物質(zhì)的減少也限制了產(chǎn)物的合成。且由于產(chǎn)物均聚集在排出的泡沫內(nèi)，發(fā)酵中途取樣所得發(fā)酵液內(nèi)只能檢測到少量產(chǎn)物，對發(fā)酵過程的監(jiān)控也造成影響。

對比后發(fā)現(xiàn)，增加泡沫收集裝置并通過蠕動泵將收集的泡沫及發(fā)酵液重新泵回發(fā)酵罐，能極大程度降低發(fā)酵過程中由于泡沫不斷排出引起的發(fā)酵液損失現(xiàn)象，使發(fā)酵液內(nèi)營養(yǎng)成分得到充分利用的同時增加發(fā)酵周期，使產(chǎn)物合成時間增加從而達到增加產(chǎn)量的目的，因此對30 L發(fā)酵罐泡進行了增加泡沫回流改造，流程見圖5。

圖5帶泡沫回流的發(fā)酵系統(tǒng)流程

3.2 攪拌轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響

在固定通入空氣量前提下,通過對比不同攪拌轉(zhuǎn)速對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以判斷發(fā)酵過程最佳溶氧控制條件以及在該條件下的脂肽最高產(chǎn)量。

圖6不同攪拌轉(zhuǎn)速對脂肽產(chǎn)量的影響

由圖6可看出，當攪拌轉(zhuǎn)速大于300 rpm時隨攪拌轉(zhuǎn)速增加發(fā)酵液產(chǎn)物含量總體呈下降趨勢，而當攪拌轉(zhuǎn)速低于300 rpm時產(chǎn)量同樣呈下降趨勢。此種現(xiàn)象可能歸因于過高的攪拌速度會使發(fā)酵罐內(nèi)產(chǎn)生劇烈而穩(wěn)定持久的泡沫，泡沫排出過快導(dǎo)致發(fā)酵液和菌體細胞的回流循環(huán)作用降低，從而導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)量減少。而當攪拌速度過低時則無法保證發(fā)酵所需溶氧條件，使菌體生長及代謝緩慢，同樣使發(fā)酵產(chǎn)量降低。攪拌轉(zhuǎn)速300 rpm條件下的脂肽產(chǎn)量達到了34 g/L。

4 結(jié)論

（1）搖瓶和30 L發(fā)酵罐實驗驗證了B.subtilis TS1726Y基因工程菌的優(yōu)化培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，表面活性素產(chǎn)量搖瓶達到26 g/L，而在30 L發(fā)酵罐達到了34 g/L，是已知文獻報道的最高表面活性素產(chǎn)量，成本已不再是制約工業(yè)化生產(chǎn)的障礙。

（2）目前化學(xué)合成表面活性劑被廣泛使用，在3次采油的油田產(chǎn)出液中含有大量化學(xué)表面活性劑，由于化學(xué)表面活性劑難降解，使后續(xù)污水處理難度大，外排污水達標難；而生物表面活性劑是微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，能夠很快被生物降解，環(huán)境友好，生物相容性好。

由于生物表面活性劑具有既親水又親油的兩性分子結(jié)構(gòu)，使其與化學(xué)表面活性劑具有類似的性能。生物表面活性劑通常比合成化學(xué)表面活性劑擁有更為復(fù)雜和龐大的分子結(jié)構(gòu)，單個分子占據(jù)更大的空間，因而顯示較低的臨界膠團濃度，它們能顯著地降低表面張力、改善界面性質(zhì)。此外，生物表面活性劑還具有選擇性好、用量少、無毒、無污染、生產(chǎn)工藝和設(shè)備簡單、耗能少等特點。