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    TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶工藝條件優(yōu)化

    2020-11-14 08:28:12張惠婷
    福建輕紡 2020年11期
    關鍵詞:縊蟶氯乙酸清液

    張惠婷

    (福建省產品質量檢驗研究院,福建 福州 350002)

    多肽是具有特定氨基酸序列的生物活性物質[1],其消化吸收率及營養(yǎng)價值均優(yōu)于蛋白質或氨基酸,且其所具有的生理功能氨基酸無法比擬[2],因此其也被稱作為生物活性肽。生物活性肽的種類較多、分布較廣[3]、食用安全性極高[4],它不但能夠提供機體生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質,還具有抗高血壓、調節(jié)免疫、抗細菌等多種功能[5]。將大分子的蛋白質酶解成小分子的多肽,不但能夠提高蛋白質的消化利用率,而且還能得到不同功能的生物活性肽。

    目前,生物活性肽常用的制備方法為酶解法[6]。在選擇利用酶解法制備生物活性肽時,挑選富含蛋白質的原料進行酶解十分關鍵??O蟶在福建又稱蟶子,其資源豐富[7],分布廣泛,富含蛋白質[8],在生物活性肽的研究方面具有極大的潛力。以資源豐富、富含蛋白質的縊蟶為原料制備生物活性肽,不但能夠充分地利用縊蟶蛋白,有效地發(fā)揮縊蟶存在的營養(yǎng)價值,還能夠充分利用縊蟶資源,具有極大的市場發(fā)展空間。

    利用酶解法制備生物活性肽時,不同種類酶的選擇可以得到不同的多肽。TPCK-胰蛋白酶是一種特異性的肽鏈內切酶,能夠專一性地切割蛋白分子中精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)位點[9]。采用具有專一性酶切位點的TPCK-胰蛋白酶對縊蟶蛋白進行酶解,可得到具有特定C末端殘基的肽段。在酶解過程中對酶解工藝條件的控制,很大程度上影響酶解的效果。因此,本試驗采用TPCK-胰蛋白酶對鮮縊蟶肉進行酶解,在單因素試驗基礎上,通過正交試驗優(yōu)選TPCK-胰蛋白酶的酶解工藝條件,為今后進一步研究制備縊蟶多肽提供數(shù)據(jù)參考。

    1 材料與設備

    1.1 材料

    鮮活縊蟶:購于福建福州永輝超市;

    TPCK-胰蛋白酶:購于上海國源生物技術有限公司,酶活性為1.1萬U/mg(反應溫度:37 ℃);

    Gly-Gly-Tyr-Arg四肽標準品:購于美國Sigma公司;

    其他試劑均為分析純。

    1.2 設備

    PB-10型pH計:賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;

    TGL-16C臺式離心機:上海安亭科學儀器廠;

    BS 224S型電子分析天平:賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;

    T6新世紀紫外可見分光光度計:北京普析通用儀器有限責任公司。

    2 試驗方法

    2.1 技術路線

    鮮活縊蟶→去殼取鮮肉絞碎→酶解→滅酶→酶解液離心→取上清液→測定多肽含量

    2.2 多肽提取量測定

    凡具有兩個直接連接的肽鍵都有雙縮脲反應[10]。因此,本文酶解液中多肽提取量的測定方法參照文獻[11,12]中的雙縮脲測定法,并作適當修改。具體測定方法如下:

    2.2.1 四肽(Gly-Gly-Tyr-Arg)標準曲線的制作

    用5%(W/V)的三氯乙酸分別配制濃度梯度為0.0~1.0 mg/mL的四肽標準溶液,將不同濃度的四肽標準溶液與雙縮脲試劑按體積比3∶2加入試管中,搖勻靜置離心,取上清液測定OD值(540 nm)。

    2.2.2 提取量測定

    稱取去殼的鮮縊蟶肉進行酶解,經(jīng)滅酶、冷卻后,將酶解產物全部轉移至100 mL容量瓶中,定容離心獲得上清液Ⅰ。取上清液Ⅰ與等體積的10%(W/V)三氯乙酸水溶液混合均勻,靜置離心獲得上清液Ⅱ。取上清液Ⅱ,用5%(W/V)的三氯乙酸水溶液定容于25 mL容量瓶中,獲得樣品溶液Ⅲ。將樣品溶液Ⅲ與雙縮脲試劑按體積比3∶2加入試管中,搖勻靜置離心,取上清液測定OD值(540 nm)。通過所得的四肽回歸方程,計算樣品溶液Ⅲ中多肽的質量濃度C(mg/mL)。以下為多肽提取量的計算公式:

    式中:

    M表示多肽提取量,即每克新鮮縊蟶肉酶解得到的多肽毫克數(shù),mg/g;

    C為樣品溶液Ⅲ中多肽的質量濃度,mg/mL;

    V1為所吸取的上清液Ⅱ的體積,mL;

    V2為樣品溶液Ⅲ的體積,mL;

    m為所稱取新鮮縊蟶肉的質量,g;

    2表示等體積的Ⅰ溶液與10%(W/V)的三氯乙酸水溶液混合后體積擴大的倍數(shù)。

    2.3 TPCK-胰蛋白酶酶解工藝研究

    2.3.1 TPCK-胰蛋白酶酶解工藝的單因素試驗

    準確稱取一定質量新鮮的去殼縊蟶肉,以pH=7.8的緩沖溶液作為反應液,在水浴溫度37 ℃條件下進行反應,分別考察酶解時間1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h、料液比1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0、1∶5.0、1∶6.0和酶添加量4500、9000、13500、18000、22500 U/g對多肽提取量的影響。按2.2.2的方法測定多肽提取量。

    2.3.2 正交試驗優(yōu)選TPCK-胰蛋白酶的酶解工藝

    在單因素試驗的基礎上,采用L9(34)正交試驗設計,優(yōu)選TPCK-胰蛋白酶的酶解工藝,試驗因素及水平見表1。

    表1 TPCK-胰蛋白酶酶解正交試驗因素及水平

    3 結果與分析

    3.1 四肽標準曲線的制作

    按本文2.2.1方法,得四肽質量濃度(X)與其光密度(Y)之間的回歸方程為:Y=0.1443X+0.0017,R2=0.9998,變量X的范圍落在0~1 mg/mL之間。

    3.2 TPCK-胰蛋白酶的酶解工藝研究及其優(yōu)化

    3.2.1 酶解時間對TPCK-胰蛋白酶酶解效果的影響

    稱取5 g新鮮去殼縊蟶肉,用pH值為7.8的緩沖溶液作為反應液,酶添加量為2250 U/g,料液比為1∶3.0,酶解溫度為37℃條件下,分別酶解1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h,酶解結果如圖1所示。由圖1可知,酶解時間在1.0~5.0 h之間時,多肽提取量呈先上升后下降的變化趨勢。當酶解時間為2.0 h左右時,多肽提取量達到單因素試驗的最高水平。而當酶解時間大于5.0 h時,多肽提取量基本保持不變。這可能是由于TPCK-胰蛋白酶是一種特異性比較強的內切酶,隨酶解時間的延長,酶解液中已沒有適合TPCK-胰蛋白酶作用位點的肽段。因此多肽提取量最終趨于平衡不變的趨勢。綜上,酶解的時間選擇為2.0 h左右較為適合。

    3.2.2 料液比對TPCK-胰蛋白酶酶解效果的影響 稱取5 g新鮮去殼的縊蟶肉,用pH值為7.8的緩沖溶液作為反應液,酶的添加量為2250 U/g,酶解溫度為37 ℃條件下,分別按料液比1∶1.0、1∶2.0、1∶3.0、1∶4.0、1∶5.0、1∶6.0酶解2.0 h,酶解結果如圖2所示。由圖2可知,料液比從1∶1.0擴大至1∶6.0,多肽提取量呈先上升后下降的變化趨勢。當料液比為1∶3.0時,多肽提取量達到單因素試驗的最高水平。當料液比大于1∶3.0時,反應體系中溶液的增多,減少了TPCK-胰蛋白酶與底物蛋白碰撞接觸的機會,導致多肽提取量下降。因此,料液比選取在1∶3.0左右。

    3.2.3 酶添加量對TPCK-胰蛋白酶酶解效果的影響 稱取5g新鮮的去殼縊蟶肉,用pH值為7.8的緩沖溶液作為反應液,酶解溫度為37 ℃,料液比為1∶3.0,酶添加量為4500、9000、13500、18000、22500 U/g條件下,分別酶解2.0 h,酶解結果如圖3所示。由圖3可知,在一定范圍內,隨酶添加量的增加,多肽提取量也相應增加。當酶添加量為18000 U/g時,多肽提取量達到單因素試驗的最高水平。當酶添加量大于18000 U/g時,多肽提取量反而開始降低。這可能是由于TPCK-胰蛋白酶將縊蟶蛋白反應完全后,酶解液中還有適合酶切位點的肽段,TPCK-胰蛋白酶對這些肽段進行酶解,使之降解成游離氨基酸,導致多肽提取量降低。綜上,TPCK-胰蛋白酶的酶添加量選擇為18000 U/g左右。

    3.2.4 TPCK-胰蛋白酶酶解工藝的正交試驗優(yōu)化結果

    通過對表2中極差R值進行比較可知,本試驗的3個因素對多肽提取量影響的主次順序為:A>B>C,即酶添加量的影響最大,酶解時間的影響最小。由K值比較得最優(yōu)水平為:A2B3C2。

    應用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對表2所得數(shù)據(jù)進行方差分析,分析的結果見表3。由表3可知,本試驗所選取的3個因素對多肽提取量的影響順序為:A>B>C,與表2極差分析的結果相一致。由方差分析結果可知,本試驗3個因素對縊蟶多肽提取量都具有顯著的影響。其中,A因素即酶的添加量的影響極顯著。綜合極差分析與方差分析的結果,選擇A2B3C2為最優(yōu)組合。

    表2 TPCK-胰蛋白酶酶解正交試驗結果

    表3 TPCK-胰蛋白酶酶解正交試驗方差分析

    以優(yōu)化所得的組合A2B3C2進行3組驗證試驗,試驗結果表明,在最優(yōu)組合下,縊蟶多肽的平均提取量可達(71.6±0.4)mg/g,表明該酶解工藝優(yōu)化成功。

    4 結論

    本研究以多肽提取量為指標,在單因素試驗的基礎上,通過正交試驗優(yōu)選TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的工藝條件,結果表明:

    TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的最佳酶解工藝為:pH=7.8、酶添加量18000 U/g、料液比(m∶V)為1∶3.5、酶解溫度37 ℃、酶解時間2.0 h。在此最優(yōu)酶解的工藝條件下,每克去殼鮮縊蟶肉可提?。?1.6±0.4)mg多肽。在對TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的工藝條件進行顯著性分析時,發(fā)現(xiàn)酶添加量、料液比、酶解時間對TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的效果都具有顯著影響,因此在TPCK-胰蛋白酶酶解縊蟶的過程中,應注意酶添加量、料液比、酶解時間的控制。

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