雞蛋中角黃素液相色譜法測定的比較

李瑞云 華鑫玲

角黃素天然存在于蛋類、肝臟、魚類等中，主要用作動物飼料添加劑，尤其在蛋類中比較容易殘留。之前我們都認(rèn)為，蛋黃越黃證明雞蛋品質(zhì)越好，但實際上這也可能是角黃素的積聚。據(jù)部分研究所得，攝取大量角黃素，可導(dǎo)致色素積聚于視網(wǎng)膜，對身體造成極大危害。本文比較了乙腈提取法、乙腈丙酮提取法、石油醚提取法的優(yōu)劣，從而得到了提取角黃素的最佳條件。

一、實驗部分

1.儀器與試劑。試劑：樣品基質(zhì)（雞蛋）、角黃素標(biāo)準(zhǔn)品、乙腈、丙酮、石油醚、乙腈丙酮提取劑（50：50）。儀器：高效液相色譜儀（安捷倫1200）、高效液相色譜儀（Waters e2695）、組織勻漿機(jī)、離心機(jī)、氮吹機(jī)、電子天平。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。角黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液（9.5μg/mL）：準(zhǔn)確稱取純度為95%的角黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1.0mg于100mL容量瓶，選用乙腈為溶劑溶解標(biāo)準(zhǔn)品，完全溶解后定容、混勻，其中角黃素濃度為9.5μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)溶液置于-18℃冰箱中避光保存。

角黃素標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取1.00mL、2.00mL、4.00mL、8.00mL、10.00mL角黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度。其中角黃素工作液濃度為0.95μg/mL、1.9μg/mL、3.8μg/mL、7.6μg/mL、9.5μg/mL。

3.分析步驟。試樣制備：取多個雞蛋，洗凈去殼后用組織勻漿機(jī)充分?jǐn)嚢杈鶆?，放入玻璃瓶中。試樣保存：將試樣?18℃避光條件下保存。提?。喊幢?所示進(jìn)行提取。

二、結(jié)果與討論

1.線性關(guān)系。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，角黃素峰面積為縱坐標(biāo)，建立回歸方程y=33.342x-1.375，R2=0.9997。

2.回收率試驗。以雞蛋為基質(zhì)空白樣品數(shù)據(jù)，見表2。然后采取空白試樣加標(biāo)回收法，確定方法回收率。稱取2g空白試樣，精密加入9.5μg/mL角黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1mL，最后計算出回收率。

3.精密度試驗。精密吸取角黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（0.95μg/mL、3.8μg/mL、9.5μg/mL），連續(xù)進(jìn)樣6次，RSD分別為0.06%、0.02%、0.01%，測定結(jié)果表明，儀器精密度良好。

同時，為測定斑蝥黃的穩(wěn)定性，在室溫20℃的條件下分別取濃度為1.9μg/mL、3.8μg/mL、7.6μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于0h、12h、24h不同時間進(jìn)樣，RSD分別為4.4%、3.9%、8.7%。測定結(jié)果表明，24h內(nèi)角黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不穩(wěn)定。

4.儀器比對。準(zhǔn)備相同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.95μg/mL、1.9μg/mL、3.8μg/mL、7.6μg/mL、9.5μg/mL，在安捷倫1200與Waters e2695同時上機(jī)。結(jié)果顯示，色譜圖中峰型均良好，Waters e2695出峰較早、峰面積較大、峰高較高，且儀器比對信噪比≥3，均適宜角黃素測定。結(jié)果見表3。

5.結(jié)論。 （1）三種提取液比較中，乙腈丙酮（50：50）提取劑回收率115.22%，石油醚提取劑回收率98.80%，乙腈提取劑回收率91.18%，可見乙腈丙酮（50：50）提取劑更適合角黃素提取。

（2）9.5μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品分別室溫放置0h、12h、24h后上機(jī)檢測，RSD%均小于10%，說明角黃素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)室溫放置24小時內(nèi)穩(wěn)定。

（3）角黃素標(biāo)準(zhǔn)品3.87μg/mL在安捷倫1200與Waters e2695同時上機(jī)，峰型均較好且信噪比均≥3，說明兩種儀器均適合角黃素檢測。

（4）角黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液9.5μg/mL在370nm、470nm、570nm下比對，發(fā)現(xiàn)470nm左右為最大吸收波長、響應(yīng)度最高，且峰型較好，570nm峰型最差，則470nm較適合角黃素檢測。

綜上，提取角黃素的最佳條件為：乙腈丙酮提取法，回收率115.22%，采用高效液相色譜法測定，色譜柱為C18（4.6mm×150mm），流動相為甲醇-水，流速1.0mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：471nm。在上述條件下，角黃素在0.95-9.5μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R2=0.9997。