淡水生物和海水生物從基因到種群水平指標(biāo)對(duì)毒性物質(zhì)的敏感性差異研究
——以銅為例

馮永亮

唐山學(xué)院基礎(chǔ)教學(xué)部，唐山 063000

物種敏感度分布(SSD)是描述不同物種對(duì)特定污染物或混合物敏感性差異的統(tǒng)計(jì)分布模型，其5%分位數(shù)(HC5)除以一個(gè)安全因子(SF)通常作為保護(hù)生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的環(huán)境閾值(即預(yù)測(cè)無(wú)效應(yīng)濃度，PNEC)，目前已成為許多國(guó)家和地區(qū)環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定和污染物生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的重要方法[1-5]。目前，用于構(gòu)建污染物SSD曲線的毒性數(shù)據(jù)主要來(lái)源于生態(tài)毒性試驗(yàn)中常規(guī)毒理指標(biāo)的急性(50%致死濃度(LC50)或50%效應(yīng)濃度(EC50))或慢性(無(wú)觀察效應(yīng)濃度(NOEC))數(shù)據(jù)，如個(gè)體的生存、死亡、生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖等。然而多數(shù)情況下，這些個(gè)體水平指標(biāo)并不能為生態(tài)系統(tǒng)安全提供充足的信息，也無(wú)法對(duì)機(jī)體損傷形成早期預(yù)警的快速響應(yīng)[6]。有研究表明，水生生物的生殖、生物化學(xué)和分子生物學(xué)指標(biāo)對(duì)一些污染物(如17α-乙炔雌二醇和壬基酚)的毒性更敏感，采用常規(guī)個(gè)體水平指標(biāo)評(píng)價(jià)其風(fēng)險(xiǎn)可能無(wú)法充分保護(hù)水生生物[7-10]。水生生物不同層次指標(biāo)對(duì)污染物的敏感性有一定差異[11]。Wo等[12]比較了鎘對(duì)海洋腹足類動(dòng)物織紋螺(Nassariusfestivus)3類指標(biāo)的亞致死效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)與繁殖凈能(scope for growth, SfG)指標(biāo)最敏感(8 d-NOEC<160 μg·L-1)，其次為RNA/DNA比例(8 d-NOEC為520 μg·L-1)，最后是傳統(tǒng)的體長(zhǎng)和體重的增長(zhǎng)(8 d-NOEC為1 000 μg·L-1)。類似的，Spurgeon等[13]研究了鋅對(duì)土壤生物蚯蚓(earthworms)的基因表達(dá)、細(xì)胞完整性和生命周期的毒性，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)是最敏感的指標(biāo)(EC50=616 μg·g-1)。如何科學(xué)地運(yùn)用不同層次指標(biāo)建立污染物的水質(zhì)基準(zhǔn)和進(jìn)行生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)尚需進(jìn)一步研究[14]。

近年來(lái)，隨著分子水平生態(tài)毒理數(shù)據(jù)的增加，一些學(xué)者開(kāi)始研究基因毒性效應(yīng)與個(gè)體水平毒性效應(yīng)之間的關(guān)系，希望搭建起微觀與宏觀指標(biāo)之間的橋梁[15]。Fedorenkova等[6]基于SSD法比較了水生生物的基因表達(dá)水平指標(biāo)與個(gè)體水平指標(biāo)對(duì)鎘的敏感性差異，發(fā)現(xiàn)鎘對(duì)基因表達(dá)的毒性平均比個(gè)體死亡毒性高11倍，但只是個(gè)體慢性毒性的1/4。相較于分子水平的指標(biāo)，有些學(xué)者認(rèn)為種群水平的指標(biāo)更適合用于生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[16]。目前，關(guān)于種群水平指標(biāo)的研究，大多是采用不同生態(tài)模型將個(gè)體水平的毒性數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為種群水平的閾值，進(jìn)而用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[17-18]，如Lin等[17]基于青鳉(Oryziaslatipes)整個(gè)生命周期的毒性數(shù)據(jù)計(jì)算了4-壬基酚(4-NP)對(duì)其種群增長(zhǎng)率的影響，并據(jù)此導(dǎo)出了種群水平的PNEC。此外，對(duì)于具有繁殖/生殖毒性類化合物，一些學(xué)者推薦使用生殖指標(biāo)的毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行環(huán)境基準(zhǔn)的建立和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[19-20]。Liu等[21]基于SSD曲線，分別推導(dǎo)了鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)對(duì)水生生物生存、生長(zhǎng)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)以及生殖指標(biāo)的PNEC，發(fā)現(xiàn)由生殖指標(biāo)導(dǎo)出的PNEC范圍為0.14～0.68 μg·L-1，顯著低于其他指標(biāo)的結(jié)果，進(jìn)而基于生殖指標(biāo)的毒性數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)了中國(guó)表層水DEHP的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。雖然，近年來(lái)學(xué)者們采用不同毒理指標(biāo)進(jìn)行污染物水質(zhì)基準(zhǔn)構(gòu)建和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[22-23]，但由于不同指標(biāo)毒性數(shù)據(jù)質(zhì)量和數(shù)量問(wèn)題，這方面研究仍處于初步探索階段[23]。

本研究以毒性數(shù)據(jù)較為豐富的銅為例，篩選了其對(duì)水生生物的基因、生化、細(xì)胞、器官、個(gè)體和種群水平的毒性數(shù)據(jù)，構(gòu)建了相應(yīng)的SSD曲線，采用雙樣本K-S檢驗(yàn)和HC5差異法比較了不同指標(biāo)間的差異，采用拐點(diǎn)分析法確定了構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需的最小樣本量。同時(shí)對(duì)不同層次指標(biāo)毒性數(shù)據(jù)在水質(zhì)基準(zhǔn)制定和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用進(jìn)行了初步探討，為銅的環(huán)境基準(zhǔn)的建立和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供了新的參考標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 數(shù)據(jù)收集

銅對(duì)不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)淡水和海水生物的毒性數(shù)據(jù)均來(lái)源于水生毒性數(shù)據(jù)庫(kù)(ECOTOX databases，http://cfpub.epa.gov/ecotox/)。數(shù)據(jù)篩選按照Klimisch等[24]給出的可靠性、相關(guān)性和適當(dāng)性原則，只選用暴露恰當(dāng)時(shí)間的毒性數(shù)據(jù)。其中，急性毒性數(shù)據(jù)的終點(diǎn)指標(biāo)選用LC50和EC50，在各個(gè)營(yíng)養(yǎng)級(jí)中的暴露時(shí)間：藻類和無(wú)脊椎動(dòng)物為≤4 d，甲殼類為1～4 d，魚類和蠕蟲為4 d，軟體動(dòng)物和兩棲類為2～4 d。慢性毒性數(shù)據(jù)的終點(diǎn)指標(biāo)選用NOEC，在各個(gè)營(yíng)養(yǎng)級(jí)中的暴露時(shí)間：藻類和無(wú)脊椎動(dòng)物≥1 d，甲殼類、魚類、軟體動(dòng)物、兩棲類動(dòng)物和蠕蟲為≥4 d。由于慢性毒性數(shù)據(jù)較少，本研究同時(shí)考慮了最大可接受毒物濃度(MATC)、最低觀測(cè)效應(yīng)濃度/水平(LOEC/LOEL)或無(wú)觀測(cè)效應(yīng)水平(NOEL)作為慢性毒性數(shù)據(jù)的終點(diǎn)指標(biāo)。當(dāng)同一物種，相同暴露終點(diǎn)、相同暴露時(shí)間具有多個(gè)數(shù)據(jù)可用時(shí)，則采用其幾何均值[25]。

根據(jù)不同層次毒理指標(biāo)，將以上收集到的銅的毒性數(shù)據(jù)分為以下7類。

(1)基因水平數(shù)據(jù)(genetic data)：包括對(duì)DNA表達(dá)或損傷、mRNA轉(zhuǎn)錄水平的抑制等數(shù)據(jù)。

(2)生化數(shù)據(jù)(biochemical data)：包括對(duì)水生生物的生物化學(xué)、酶以及激素方面的效應(yīng)，如酶活性的感應(yīng)或抑制、應(yīng)激蛋白表達(dá)的變化等。

(3)細(xì)胞水平數(shù)據(jù)(cell data)：包括對(duì)各種組織細(xì)胞(如鰓、肝臟和血液)的形狀、數(shù)量以及內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響，如血液中白細(xì)胞數(shù)量、藻類細(xì)胞器(線粒體)的變化和魚類紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化等。

(4)器官水平數(shù)據(jù)(organ data)：包括生物生命周期中任意時(shí)期骨骼或發(fā)育的器官組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化，如軟體動(dòng)物殼的長(zhǎng)度、兩棲類尾部的長(zhǎng)度和變態(tài)過(guò)程、魚類和兩棲類肝臟指數(shù)(肝臟重量/個(gè)體重量)和性腺指數(shù)(性腺重量/個(gè)體重量)等。

(5)個(gè)體水平急性數(shù)據(jù)(individual acute data)：包括對(duì)水生生物生存的半數(shù)致死數(shù)據(jù)(LC50)以及對(duì)生長(zhǎng)的半數(shù)抑制數(shù)據(jù)(EC50)。

(6)個(gè)體水平慢性數(shù)據(jù)(individual chronic data)：包括對(duì)水生生物的生存、生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖影響的數(shù)據(jù)。

(7)種群水平數(shù)據(jù)(population data)：包括對(duì)水生生物(主要為藻類)種群增長(zhǎng)率、生物量、豐度、性別比例、葉綠素a濃度、多樣性和均勻度等指標(biāo)影響的數(shù)據(jù)。

1.2 不同毒理指標(biāo)SSD的構(gòu)建與差異性比較

首先，將物種的毒性值按從小到大的順序進(jìn)行排列，并且給其分配等級(jí)R，按照下式計(jì)算每個(gè)物種的累計(jì)概率。

式中：P為累計(jì)概率(%)，R為物種排序的等級(jí)，N為物種個(gè)數(shù)。然后以濃度和累計(jì)概率分別為X軸和Y軸建立坐標(biāo)系，并根據(jù)不同生物的毒性值和累計(jì)概率標(biāo)出這些數(shù)據(jù)點(diǎn)。最后選用Log-normal、Log-logistic、Weibull和Burr Ⅲ分布(包括Burr Ⅲ的極限分布ReWeibull)對(duì)這些數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行分布擬合，得到銅對(duì)水生生物7類不同指標(biāo)的SSD曲線。擬合過(guò)程中所有參數(shù)均采用極大似然估計(jì)。Anderson-Darling(A-D)檢驗(yàn)用于模型的擬合優(yōu)度檢驗(yàn)[7]。擬合模型在X軸和Y軸的偏差平方和[26]以及AIC(Akaike information criterion)值[27]用于最優(yōu)SSD模型的選擇。

采用雙樣本K-S檢驗(yàn)進(jìn)行銅的不同毒理指標(biāo)SSD間的差異性比較[28-29]；采用在水質(zhì)基準(zhǔn)建立過(guò)程中以及比較本地種與非本地種敏感性差異研究中給出的重要點(diǎn)位差異法進(jìn)行重要點(diǎn)位HC5間的差異性比較，當(dāng)不同層次指標(biāo)的HC5差異在2倍以內(nèi)時(shí)認(rèn)為無(wú)差異，在一個(gè)數(shù)量級(jí)以內(nèi)有一定差異，超過(guò)一個(gè)數(shù)量級(jí)有較大差異[30-32]。此外，本研究采用統(tǒng)計(jì)外推法(即利用HC5除以一個(gè)安全因子SF)，來(lái)計(jì)算環(huán)境保護(hù)閾值PNEC，其中，SF取保守值5[33]。

1.3 最小樣本量的確定

本研究基于HC5值隨樣本量的變化情況來(lái)確定獲得穩(wěn)定SSD所需的最小樣本量。具體過(guò)程如下：對(duì)每一個(gè)給定的數(shù)據(jù)集(此處為銅對(duì)水生生物不同指標(biāo)的毒性數(shù)據(jù)集，設(shè)其樣本量為N)，從中有放回地隨機(jī)抽取5 000個(gè)樣本量為n的模擬樣本，基于這些模擬樣本，通過(guò)參數(shù)Bootstrap[34-35]方法計(jì)算HC5及其95%置信區(qū)間(95% CI)，然后對(duì)每一個(gè)樣本量為n(范圍為2～N)的樣本，重復(fù)上述過(guò)程。通過(guò)上述過(guò)程，每個(gè)給定的數(shù)據(jù)集(樣本量為N)都會(huì)獲得一個(gè)大小為N-1的HC5序列，基于這個(gè)HC5序列，采用拐點(diǎn)分析(change point analysis)來(lái)確定HC5值趨于穩(wěn)定時(shí)所需的最小樣本量。拐點(diǎn)分析經(jīng)常用于將一個(gè)序列分成具有不同性質(zhì)(如均值和方差)的2個(gè)部分[36]。本研究在0.05的顯著性水平下，基于方差的變化確定HC5序列的拐點(diǎn)，即構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需的最小樣本量。由于采用Bootstrap方法確定HC5值至少需要20個(gè)數(shù)據(jù)[35]，因此，對(duì)毒性數(shù)據(jù)量少于20的淡水基因數(shù)據(jù)集、海水細(xì)胞和器官數(shù)據(jù)集并未進(jìn)行最小樣本量估計(jì)。本研究的數(shù)據(jù)模擬和統(tǒng)計(jì)分析均采用R軟件(Version 3.6.0)，需要添加的軟件包有fitdistrplus、ADGofTest以及changepoint。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 不同毒理指標(biāo)數(shù)據(jù)

本研究共篩選出銅對(duì)淡水生物的毒性數(shù)據(jù)742個(gè)，對(duì)海洋生物的毒性數(shù)據(jù)628個(gè)，涵蓋了水生生態(tài)系統(tǒng)的7個(gè)主要功能群：藻類、兩棲類、甲殼類、魚類、無(wú)脊椎動(dòng)物、軟體動(dòng)物和蠕蟲類。其中，銅對(duì)淡水生物的基因、生化、細(xì)胞、器官、個(gè)體急性、個(gè)體慢性和種群水平的毒性數(shù)據(jù)量分別為16、92、25、28、375、113和93個(gè)，對(duì)海洋生物的毒性數(shù)據(jù)量分別為26、91、13、16、291、109和82個(gè)(表1)。生化指標(biāo)、個(gè)體急性、個(gè)體慢性和種群水平指標(biāo)的毒性數(shù)據(jù)相對(duì)充足，而基因、細(xì)胞和器官水平指標(biāo)毒性數(shù)據(jù)相對(duì)較少，但也滿足了Wheeler等[37]提出的構(gòu)建SSD曲線所需最少10個(gè)數(shù)據(jù)的要求以及美國(guó)環(huán)境保護(hù)局(US EPA)[1]提出的“三門8科”的要求。此外，海水生物和淡水生物各個(gè)層次指標(biāo)所包含功能群的種類和比例也有較大差異(圖1)。比如，淡水生物的生化、個(gè)體水平指標(biāo)均包含了7個(gè)功能群，而基因和器官水平指標(biāo)僅包含了4個(gè)功能群，種群水平數(shù)據(jù)中藻類所占比例高達(dá)63.00%等。

圖1 銅對(duì)水生生物不同層次指標(biāo)所包含功能群的比例注：(a)為淡水生物毒性數(shù)據(jù)比例；(b)為海水生物毒性數(shù)據(jù)比例。Fig. 1 The percentage of toxicity data of different endpoints of copper to different aquatic species groupsNote: (a) percentage of different species groups for freshwater organisms; (b) percentage of different species groups for seawater organisms.

表1 銅的不同毒理指標(biāo)毒性數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)性質(zhì)和物種敏感度分布相關(guān)參數(shù)Table 1 Statistic characteristics of toxicity data and the parameters of species sensitivity distribution for copper based on different endpoints

2.2 基于SSD的不同毒理指標(biāo)對(duì)銅的敏感性比較

A-D檢驗(yàn)結(jié)果表明，Log-normal、Log-logistic和Burr Ⅲ分布均能較好地?cái)M合所有層次指標(biāo)數(shù)據(jù)集(P>0.05)，Weibull分布對(duì)于數(shù)據(jù)量較少的數(shù)據(jù)集(海洋生物的基因、細(xì)胞和器官指標(biāo)，淡水生物的基因和細(xì)胞指標(biāo))的擬合能夠通過(guò)檢驗(yàn)，而對(duì)于數(shù)據(jù)量較大的其他數(shù)據(jù)集的擬合效果較差(P<0.05)。4種分布在X軸和Y軸的偏差平方和以及AIC結(jié)果均表明，Burr Ⅲ分布能夠較好地?cái)M合各個(gè)數(shù)據(jù)集，尤其是數(shù)據(jù)量>30的數(shù)據(jù)集。因此，本研究以下分析結(jié)果均采用Burr Ⅲ分布(或ReWeibull分布)作為各個(gè)數(shù)據(jù)集的SSD模型。

銅對(duì)淡水生物不同毒理指標(biāo)的SSD曲線如圖2(a)所示。由圖2(a)可知，個(gè)體慢性指標(biāo)SSD(主要在低值區(qū)域)位于其他6類指標(biāo)SSD的左側(cè)，個(gè)體急性指標(biāo)SSD位于其他6類指標(biāo)(種群指標(biāo)的高值區(qū)域除外)的右側(cè)，表明淡水生物個(gè)體慢性指標(biāo)對(duì)銅最敏感，個(gè)體急性指標(biāo)最不敏感。雙樣本K-S檢驗(yàn)結(jié)果表明(表2)，基因、器官、生化和個(gè)體慢性和種群指標(biāo)SSD與個(gè)體急性指標(biāo)的SSD均有顯著差異(ks=0.17～0.45,P<0.05)，個(gè)體慢性指標(biāo)SSD與生化和種群指標(biāo)SSD均具有顯著差異(ks=0.19～0.26,P<0.05)。此外，基因、細(xì)胞、器官和生化指標(biāo)的SSD曲線相對(duì)較近，差異不顯著(ks=0.13～0.30,P=0.06～0.95)。SSD重要點(diǎn)位HC5的比較結(jié)果顯示，基因、細(xì)胞、器官、生化、個(gè)體急性和種群指標(biāo)HC5與個(gè)體慢性指標(biāo)HC5均具有一定差異(3.15倍～8.28倍)，細(xì)胞和個(gè)體急性HC5值分別為種群水平HC5值的2.13倍和2.46倍，具有一定差異。淡水生物7類指標(biāo)對(duì)Cu的敏感順序?yàn)椋簜€(gè)體慢性(HC5=1.24 μg·L-1)>種群(HC5=4.17 μg·L-1)≥器官(HC5=4.78 μg·L-1)>生化(HC5=5.40 μg·L-1)≥基因(HC5=7.38 μg·L-1)≥細(xì)胞(HC5=8.88 μg·L-1)>個(gè)體急性(HC5=10.27 μg·L-1)。

圖2 銅對(duì)水生生物不同層次指標(biāo)的物種敏感性曲線注：(a)為淡水生物；(b)為海水生物。Fig. 2 The species sensitivity distribution curves of copper based on different toxicological endpoints of aquatic organismsNote: (a) freshwater organisms; (b) seawater organisms.

表2 基于雙樣本K-S檢驗(yàn)和重要點(diǎn)位差異法(HC5)的不同毒理指標(biāo)對(duì)銅的敏感性差異比較Table 2 Comparison of different level tested endpoints for copper using the two-sample K-S test and important points (HC5)

銅對(duì)海洋生物不同毒理指標(biāo)的SSD曲線如圖2(b)所示。個(gè)體急性指標(biāo)SSD位于其他6類指標(biāo)的右側(cè)，表明基因、細(xì)胞、器官、生化、個(gè)體慢性和種群指標(biāo)相較于個(gè)體水平急性指標(biāo)對(duì)銅更為敏感。雙樣本K-S檢驗(yàn)結(jié)果表明，個(gè)體急性指標(biāo)與其他6類指標(biāo)的SSD曲線均具有顯著差異(ks=0.25～0.56,P<0.01)。除個(gè)體急性指標(biāo)外，其他6類指標(biāo)SSD曲線的相對(duì)位置較近，差異不顯著(ks=0.10～0.36,P=0.06～0.97)。此外，種群指標(biāo)的SSD曲線較為平緩，毒性數(shù)據(jù)范圍大，其中，低值區(qū)域相對(duì)較為敏感，高值區(qū)域相對(duì)不敏感。重要點(diǎn)HC5的比較結(jié)果顯示，基因指標(biāo)的HC5是器官和種群指標(biāo)HC5的0.86倍和0.85倍，是細(xì)胞、生化、個(gè)體急性和個(gè)體慢性指標(biāo)HC5值的0.27倍、0.27倍、0.12倍和0.34倍，即基因指標(biāo)與器官和種群指標(biāo)的HC5值無(wú)差異，與其他4類指標(biāo)有一定差異。細(xì)胞水平指標(biāo)的HC5分別為器官、個(gè)體急性和種群指標(biāo)HC5的3.19倍、0.45倍和3.16倍，有一定的差異。此外，器官水平指標(biāo)HC5與生化、個(gè)體急性和個(gè)體慢性HC5有一定差異(0.14倍～0.39倍)，生化指標(biāo)HC5與個(gè)體慢性指標(biāo)HC5有一定差異，個(gè)體急性指標(biāo)HC5與個(gè)體慢性和種群指標(biāo)HC5具有一定差異。海洋生物7類指標(biāo)對(duì)銅的敏感順序?yàn)椋夯?HC5=1.53 μg·L-1)≥器官(HC5=1.78 μg·L-1)≥種群(HC5=1.80 μg·L-1)>個(gè)體慢性(HC5=4.55 μg·L-1)≥生化(HC5=5.63 μg·L-1)≥細(xì)胞(HC5=5.68 μg·L-1)>個(gè)體急性(HC5=12.50 μg·L-1)。

2.3 構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需的最小樣本量

基于銅對(duì)水生生物個(gè)體急性和個(gè)體慢性毒性數(shù)據(jù)所得的HC5值及其95% CI隨樣本量增加的變化情況如圖3所示。由圖3可知，HC5值隨著樣本量的增加而快速減小，拐點(diǎn)分析顯示，對(duì)于淡水生物，當(dāng)樣本量分別達(dá)到22和9時(shí)，其個(gè)體急性和個(gè)體慢性的HC5值隨樣本量增加不再有顯著變化，即淡水個(gè)體急性和個(gè)體慢性毒性數(shù)據(jù)集構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需最小樣本量分別為22和9。類似的，對(duì)于海洋生物，其個(gè)體急性和個(gè)體慢性毒性數(shù)據(jù)集構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需最小樣本量分別為17和10。此外，淡水生物細(xì)胞、器官、生化以及種群毒性數(shù)據(jù)構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需最小樣本量分別為5、5、8和9，海水生物基因、生化以及種群毒性數(shù)據(jù)構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需最小樣本量分別為5、9和8。

圖3 HC5值隨樣本量增加的變化趨勢(shì)注：(a)淡水生物個(gè)體急性；(b)淡水生物個(gè)體慢性；(c)海水生物個(gè)體急性；(d)海水生物個(gè)體慢性。Fig. 3 Variation of HC5 estimation against sample sizeNote: (a) individual acute endpoint for freshwater organisms; (b) individual chronic endpoint for freshwater organisms; (c) individual acute endpoint for seawater organisms; (d) individual chronic endpoint for seawater organisms.

3 討論(Discussion)

目前，SSD的構(gòu)建和水質(zhì)基準(zhǔn)的推導(dǎo)大多采用傳統(tǒng)的個(gè)體水平指標(biāo)毒性數(shù)據(jù)，如US EPA[38]基于個(gè)體水平的急性和慢性毒性數(shù)據(jù)，給出了銅對(duì)淡水和海水的急性基準(zhǔn)值(CMC)和慢性基準(zhǔn)值(CCC)。本研究基于水生生物個(gè)體急性和慢性指標(biāo)所得HC5值均與US EPA所給標(biāo)準(zhǔn)值處于同一數(shù)量級(jí)。其中，基于淡水生物個(gè)體急性指標(biāo)得出的HC5(10.27 μg·L-1)略小于CMC(13 μg·L-1)，而個(gè)體慢性指標(biāo)所得HC5(1.24 μg·L-1)僅為CCC(9 μg·L-1)的0.14倍?；诤Ｑ笊飩€(gè)體急性指標(biāo)得出的HC5(12.50 μg·L-1)為CMC(4.8 μg·L-1)的2.6倍，個(gè)體慢性指標(biāo)所得HC5(4.55 μg·L-1)略大于CCC(3.1 μg·L-1)。此外，由于推導(dǎo)方法以及SF選取的差異，本研究基于個(gè)體水平所得PNEC均低于US EPA所給標(biāo)準(zhǔn)值(表1)。目前，國(guó)際上普遍采用的推導(dǎo)污染物水質(zhì)基準(zhǔn)的方法包括評(píng)價(jià)因子法、毒性百分?jǐn)?shù)排序法和SSD外推法。US EPA采用的毒性百分?jǐn)?shù)排序法是把所獲得的物種的屬平均毒性值按從小到大的順序進(jìn)行排列，其中，CMC等于最終急性值的1/2[39]。而本研究所采用的是我國(guó)在《淡水水生生物水質(zhì)基準(zhǔn)制定技術(shù)指南》推薦的SSD外推法，是將單個(gè)物種的毒性數(shù)據(jù)進(jìn)行排序，并且推導(dǎo)PNEC時(shí)SF選取的是保守值5[33]。

本研究雙樣本K-S檢驗(yàn)結(jié)果顯示，除個(gè)體急性指標(biāo)外，其他指標(biāo)的SSD曲線差異均不顯著，各個(gè)指標(biāo)HC5結(jié)果顯示，個(gè)體急性指標(biāo)為最不敏感指標(biāo)，其次為細(xì)胞水平指標(biāo)，種群水平指標(biāo)較為敏感。本文結(jié)論與人們普遍認(rèn)為的環(huán)境污染物導(dǎo)致的生態(tài)系統(tǒng)逐級(jí)響應(yīng)順序(即不同層次指標(biāo)對(duì)污染物的敏感順序應(yīng)該為基因>細(xì)胞>器官>個(gè)體>種群)有較大差異[13]。原因之一可能是各個(gè)層次指標(biāo)所包含的生物功能群有較大差異(圖1)，不同功能群對(duì)銅的敏感性不同。Wong等[40]發(fā)現(xiàn)水蚤類生物對(duì)鎘和銅的敏感性要明顯大于橈足類。孔祥臻等[41]發(fā)現(xiàn)淡水生物甲殼類和無(wú)脊椎動(dòng)物對(duì)銅的敏感性要明顯大于魚類，而甲殼類的敏感性略大于無(wú)脊椎動(dòng)物。類似的，杜建國(guó)等[42]發(fā)現(xiàn)銅對(duì)海洋藻類和甲殼類動(dòng)物的毒性較大，對(duì)于軟體動(dòng)物的毒性相對(duì)較小，且當(dāng)銅的濃度低于1 000 μg·L-1時(shí)，其對(duì)無(wú)脊椎動(dòng)物的毒性大于魚類的毒性。此外，隨著現(xiàn)代技術(shù)在分子生物學(xué)中的應(yīng)用，大量亞個(gè)體水平效應(yīng)被量化(如mRNA轉(zhuǎn)錄、基因的表達(dá)量等)，但很難將其與高層次的生物學(xué)組織水平的生態(tài)效應(yīng)相關(guān)聯(lián)[23]，這也是導(dǎo)致本研究中不同層次指標(biāo)對(duì)銅的敏感性順序不呈逐級(jí)響應(yīng)的一個(gè)重要原因。例如，本研究中基因、生化指標(biāo)大多都選用的是與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的酶或者基因，這些指標(biāo)可能并不是對(duì)銅最早應(yīng)激響應(yīng)的靶指標(biāo)，進(jìn)而導(dǎo)致其敏感性并未顯著高于其他層次指標(biāo)(個(gè)體急性指標(biāo)除外)。

銅對(duì)水生生物基因、細(xì)胞、器官、生化和個(gè)體慢性指標(biāo)的敏感性要顯著高于個(gè)體急性指標(biāo)(圖2)。個(gè)體水平急性指標(biāo)一般采用LC50或EC50作為評(píng)價(jià)終點(diǎn)，而其他幾類指標(biāo)所用大多為慢性評(píng)價(jià)終點(diǎn)(如NOEC)，暴露時(shí)間短是導(dǎo)致個(gè)體急性指標(biāo)比其他指標(biāo)不敏感的一個(gè)重要原因。目前，銅對(duì)水生生物種群水平效應(yīng)的研究主要集中于藻類的群增長(zhǎng)率、生物量、豐度以及葉綠素含量等指標(biāo)，藻類(尤其是微藻類)作為大多數(shù)淡水和海水生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ)物種，對(duì)銅的敏感性較大。Levy等[43]報(bào)道銅對(duì)海洋微藻中鼓藻(Bellerocheapolymorpha)、微胞藻(Micromonaspusilla)、大洋橋石藻(Gephyrocapsaoceanica)、溝狀蛋白藻(Proteomonassulcata)和鈣板金藻(Coccolithushuxleyi)種群增長(zhǎng)率的3 d-NOEC分別為0.2、0.3、1.3、5和8 μg·L-1。這些較為敏感的微藻類生物分布在種群指標(biāo)SSD曲線的低值區(qū)域，導(dǎo)致其HC5值相對(duì)較小。Iwasaki等[18]基于種群模型，估算了銅對(duì)13種淡水生物種群效應(yīng)閾值(種群增長(zhǎng)率為0)，構(gòu)建了種群水平的SSD曲線，發(fā)現(xiàn)與個(gè)體水平閾值的SSD并無(wú)顯著差異，與本研究雙樣本K-S檢驗(yàn)的結(jié)果一致。本研究中淡水生物個(gè)體慢性指標(biāo)為各個(gè)層次指標(biāo)中最敏感的指標(biāo)，其HC5顯著低于基因、細(xì)胞和器官等低層次指標(biāo)。類似的，Yan等[15]基于SSD法分析了基因效應(yīng)數(shù)據(jù)和個(gè)體水平急性、慢性效應(yīng)數(shù)據(jù)對(duì)鎘的敏感性，發(fā)現(xiàn)3種效應(yīng)數(shù)據(jù)對(duì)鎘的敏感度排序?yàn)閭€(gè)體慢性>基因效應(yīng)>個(gè)體急性。此外，本研究HC5結(jié)果顯示，海水生物的基因和器官指標(biāo)的敏感性顯著高于個(gè)體層次指標(biāo)，而淡水生物的基因、器官等亞個(gè)體指標(biāo)的敏感性要顯著低于個(gè)體慢性指標(biāo)，表明基因效應(yīng)等亞個(gè)體指標(biāo)具有作為生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)早期預(yù)警指標(biāo)的應(yīng)用潛力，但基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)尚難以大范圍地支持其在我國(guó)水質(zhì)基準(zhǔn)修訂和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。

目前，用于生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的毒性數(shù)據(jù)絕大部分來(lái)自于個(gè)體或亞個(gè)體水平的研究，而其所關(guān)心的生態(tài)終點(diǎn)往往是種群水平(或更高水平)的效應(yīng)，有限可用毒性數(shù)據(jù)與所關(guān)心的生態(tài)保護(hù)目標(biāo)不匹配是生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的一個(gè)主要問(wèn)題[23]。有害結(jié)局路徑(AOPs)概念的提出從一定程度上解決了亞個(gè)體效應(yīng)與生態(tài)保護(hù)目標(biāo)的關(guān)聯(lián)問(wèn)題[44]。但目前基于AOPs概念進(jìn)行水質(zhì)基準(zhǔn)建立和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的研究主要集中于環(huán)境雌激素類物質(zhì)[45]，尚難以大范圍應(yīng)用到其他物質(zhì)。筆者認(rèn)為若要將基因、生化等效應(yīng)數(shù)據(jù)與個(gè)體或種群水平效應(yīng)聯(lián)系起來(lái)用于生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和管理，在同一個(gè)AOPs上每個(gè)生物組織層次都應(yīng)找到至少一個(gè)有意義的敏感指標(biāo)。

目前，許多機(jī)構(gòu)和學(xué)者都對(duì)構(gòu)建SSD模型所需的最小毒性數(shù)據(jù)量做了規(guī)定和研究[1-2,5,34,37,46]，但這些規(guī)定主要是基于毒性數(shù)據(jù)的代表性和有效性的角度給出的，如我國(guó)在《淡水水生生物水質(zhì)基準(zhǔn)制定技術(shù)指南》(HJ 831—2017)[5]中指出構(gòu)建SSD模型的毒性數(shù)據(jù)應(yīng)該至少涵蓋3個(gè)營(yíng)養(yǎng)級(jí)的5種生物，US EPA[1]指出構(gòu)建SSD曲線的數(shù)據(jù)需滿足“3門8科”且為本土水生動(dòng)物的毒性數(shù)據(jù)的要求。毒性數(shù)據(jù)的代表性和有效性是構(gòu)建一個(gè)可靠SSD模型的基礎(chǔ)，然而，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度看，滿足上述毒性數(shù)據(jù)要求所構(gòu)建的SSD并不能保證其輸出結(jié)果(HC5)的穩(wěn)定性。Zhao和Chen[27]基于毒死蜱對(duì)水生生物的3個(gè)數(shù)據(jù)集(數(shù)據(jù)量分別為144、167和207)，采用拐點(diǎn)分析法，得出基于參數(shù)方法構(gòu)建SSD曲線所需最小樣本量分別為10、11和11。類似的，Zhang等[47]基于壬基酚對(duì)淡水生物的急性和慢性毒性數(shù)據(jù)(數(shù)據(jù)量分別為27和22)，采用拐點(diǎn)分析法，得出參數(shù)方法獲得穩(wěn)定HC5輸出所需最小樣本量分別為12和13。本研究基于HC5值的方差變化情況，采用拐點(diǎn)分析法得到了基于銅的淡水和海水個(gè)體慢性毒性數(shù)據(jù)構(gòu)建穩(wěn)定SSD曲線所需最小樣本量分別為9和10，與上述文獻(xiàn)結(jié)果基本一致，而淡水和海水個(gè)體急性毒性數(shù)據(jù)所需最小樣本量分別為22和17，大于上述文獻(xiàn)結(jié)果。此外，值得注意的一個(gè)趨勢(shì)是，數(shù)據(jù)量越大的毒性數(shù)據(jù)集(如個(gè)體急性數(shù)據(jù)集)，其獲得穩(wěn)定HC5所需最小樣本量也越大。一般的，數(shù)據(jù)量大的毒性數(shù)據(jù)集由于其方差和經(jīng)驗(yàn)分布的范圍較大，獲得穩(wěn)定HC5所需最小樣本量也會(huì)更大[27]。因此，本研究推導(dǎo)出銅的最小樣本量并不能簡(jiǎn)單地推廣到其他污染物的毒性數(shù)據(jù)集上。筆者建議，在搜索獲得某個(gè)污染物毒性數(shù)據(jù)后，應(yīng)先推導(dǎo)出獲得穩(wěn)定HC5所需的最小樣本量，然后再進(jìn)行毒性數(shù)據(jù)篩選，最后篩選出的毒性數(shù)據(jù)量需要大于上述所得的最小樣本量，才能保證其所構(gòu)建的SSD在統(tǒng)計(jì)上具有穩(wěn)定性。

綜上所述：水生生物不同層次指標(biāo)對(duì)銅的敏感性并沒(méi)有呈現(xiàn)出逐級(jí)響應(yīng)的關(guān)系?；陔p樣本K-S檢驗(yàn)的結(jié)果表明，水生生物個(gè)體急性指標(biāo)對(duì)銅的敏感性要顯著低于其他指標(biāo)，淡水生物的個(gè)體慢性指標(biāo)的敏感性顯著高于生化和種群指標(biāo)?；贖C5差異法的結(jié)果顯示，淡水生物不同指標(biāo)對(duì)銅的敏感順序?yàn)椋簜€(gè)體慢性>種群≥器官>生化≥基因≥細(xì)胞>個(gè)體急性，海水生物不同指標(biāo)對(duì)銅的敏感順序?yàn)椋夯颉萜鞴佟莘N群>個(gè)體慢性≥生化≥細(xì)胞>個(gè)體急性。基于拐點(diǎn)分析法的結(jié)果顯示，淡水生物細(xì)胞、器官、生化、個(gè)體急性、個(gè)體慢性以及種群毒性數(shù)據(jù)構(gòu)建穩(wěn)定SSD所需最小樣本量分別為5、5、8、22、9和9，海水生物基因、生化、個(gè)體急性、個(gè)體慢性以及種群毒性數(shù)據(jù)分別為5、9、17、10和8。

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