榿葉唐棣外植體滅菌試驗(yàn)研究

黃立華

(遼寧省旱地農(nóng)林研究所，遼寧 朝陽 122000)

榿葉唐棣(Amelanchieralnifolia)為薔薇科唐棣屬落葉小喬木或灌木，原產(chǎn)北美洲，在歐洲多國有栽培。果實(shí)為漿果，含有多種營養(yǎng)成分，鮮果含鈣量高達(dá)0.88 g·kg-1，可鮮食可加工，主要用于釀酒、制造食品、果醬、藥品和飲料。作為北美洲重要經(jīng)濟(jì)樹種，是國際新興的第三代水果典型代表。

遼寧省干旱地區(qū)造林研究所在我國最早種植榿葉唐棣，從加拿大引進(jìn)，并在許多省(市、區(qū))開展了區(qū)域試驗(yàn)和引種栽培研究，自此榿葉唐棣作為新型優(yōu)良經(jīng)濟(jì)林樹種在我國被重視。但優(yōu)質(zhì)適生種質(zhì)資源少、扦插繁殖生根率低、無性繁殖難、后代變異嚴(yán)重、母本優(yōu)良性狀難保持等問題嚴(yán)重。為此我們進(jìn)行了榿葉唐棣組織培養(yǎng)技術(shù)研究并獲得成功，尤其在外植體消毒滅菌——無菌組織培養(yǎng)關(guān)鍵環(huán)節(jié)取得成功，篩選出了榿葉唐棣外植體消毒滅菌最佳方案，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

6月采集的當(dāng)年生榿葉唐棣健壯帶腋芽莖段。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體材料清洗 將供試外植體帶回準(zhǔn)備室，剪掉葉片，在流水下用軟毛刷沖洗、刷掉表面塵土，剪成帶單芽的莖段，置于燒杯中，加入肥皂水浸洗，大約浸攪5 min，然后再用自來水沖洗凈肥皂液，將燒杯口用紗布扎住，置自來水龍頭下沖洗2～3 h備用。

1.2.2 外植體材料消毒滅菌 在超凈工作臺(tái)將外植體材料轉(zhuǎn)放到消過毒的燒杯中，倒入75%酒精浸泡30 s，用無菌水沖洗2～3次，然后倒入已經(jīng)配好的消毒溶液(表1)，用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，使外植體材料各部分與消毒溶液充分接觸，達(dá)到徹底消毒效果。在快達(dá)到預(yù)定時(shí)間之前的1～2 min,把消毒溶液全部倒出，立即倒入無菌水，輕輕攪動(dòng)涮洗。外植體材料消毒時(shí)間為倒入消毒溶液至倒入無菌水。無菌水涮洗每次3 min左右，涮洗3～8次，至消毒溶液涮洗干凈為止。

表1 消毒溶液濃度消毒時(shí)間

1.2.3 外植體接種 在超凈工作臺(tái)，將沖洗干凈、瀝干水分的外植體按無菌操作要求，切成長約1 cm、具1～2個(gè)腋芽的莖段，插入固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每瓶接種1個(gè)芽，每種處理接種50瓶。

1.2.4 培養(yǎng)基的配制 培養(yǎng)基配方：MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.08 mg·L-1+白糖35 mg·L-1+瓊脂8 mg·L-1。pH值5.5～5.8。1.1 kg·cm-2,121 ℃滅菌20 min。

1.2.5 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度控制在(23±2) ℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 Lx，光照時(shí)間為14～16 h·d-1。

1.2.6 培養(yǎng)反應(yīng)的觀察與統(tǒng)計(jì) 培養(yǎng)3 d后，觀察污染情況，將污染瓶清理出培養(yǎng)室；培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)污染情況；培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率與成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 HgCl不同消毒時(shí)間對(duì)外植體成活的影響

培養(yǎng)3 d后觀察，HgCl消毒4 min莖段最早出現(xiàn)污染，以后其它消毒時(shí)間處理的莖段也陸續(xù)出現(xiàn)污染；培養(yǎng)7 d后，消毒10 min以上的莖段開始出現(xiàn)褐化，10 d后消毒8 min的莖段出現(xiàn)褐化，直至培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)，滅菌6 min莖段只有1瓶褐化苗，滅菌4 min無褐化苗。從表2中可以看出，滅菌12 min褐化率最高，為56%，成活率最低，為14%；滅菌4 min，雖無褐化苗，但污染率高達(dá)100%；外植體成活率在滅菌10 mim時(shí)到達(dá)最高，為52%。

表2 HgCl不同消毒時(shí)間的外植體污染率、褐化率、成活率

HgCl消毒時(shí)間與外植體污染率、褐化率、成活率的關(guān)系是隨著消毒時(shí)間的增加污染率降低，褐化率升高；成活率在消毒時(shí)間≤10 min時(shí)，隨消毒時(shí)間延長而升高，消毒時(shí)間>10 min后又下降。

2.2 NaClO不同消毒時(shí)間對(duì)外植體成活率的影響

培養(yǎng)3 d后觀察，NaClO消毒處理的莖段污染瓶數(shù)較多，培養(yǎng)15 d左右，滅菌10 min以下的莖段已全部被污染。從表3中可以看出，NaClO滅菌時(shí)間≤10 min，莖段污染率100%；滅菌時(shí)間>10 min，污染率稍降低，但同時(shí)褐化現(xiàn)象輕微發(fā)生，成活率仍較低；滅菌25 min時(shí)成活率最高，為8%。

表3 NaClO不同消毒時(shí)間的外植體污染率、褐化率、成活率

NaClO消毒時(shí)間與外植體污染率、褐化率、成活率的關(guān)系是，外植體污染率消毒時(shí)間在10 min以內(nèi)為100%，隨著消毒時(shí)間的增加，污染率逐漸降低，但始終保持在70%以上的較高水平；外植體褐化率消毒時(shí)間超過10 min后，隨著消毒時(shí)間的增加而逐漸增加，消毒時(shí)間為30 mim時(shí)，褐化率達(dá)到最高；成活率在消毒時(shí)間≤8 min 時(shí),隨消毒時(shí)間延長而升高，消毒時(shí)間超過8min之后，又下降。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)結(jié)果為，外植體滅菌，消毒處理時(shí)間很關(guān)鍵，但滅菌劑的選擇也至關(guān)重要。用5%NaClO滅菌消毒，消毒時(shí)間低于10 min，污染率100%，高于10 min,污染率略有下降，但褐化率隨之增加，最高成活率僅為8%； 5%的NaClO消毒效果達(dá)不到實(shí)際應(yīng)用的要求，不適合做榿葉唐棣外植體滅菌劑。用0.1%HgCl對(duì)榿葉唐棣外植體消毒10 min，污染率32%，褐化率16%，成活率52%；0.1%HgCl消毒10 min是榿葉唐棣外植體比較理想的滅菌消毒方法。表明只要達(dá)到足夠消毒時(shí)間，較低濃度的HgCl也能達(dá)到有效滅菌效果，建立榿葉唐棣無菌繁殖體系。

進(jìn)行外植體消毒滅菌，方可保證無菌組織培養(yǎng)的進(jìn)行。在對(duì)外植體消毒滅菌，確定消毒劑種類、消毒濃度、消毒時(shí)間，要考慮外植體不同取材部位、取材季節(jié)、取材大小，其帶菌程度不同，對(duì)不同種類、不同濃度的消毒劑的敏感度也不一樣，選擇的滅菌方案既要消滅材料上的病菌，同時(shí)又不損傷或只輕微損傷組織材料而不影響其生長。操作過程中，仔細(xì)理解并牢固建立“無菌”思想，時(shí)時(shí)處處嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作要求。只要做到這些，就可建立無菌繁殖體系。