正交法優(yōu)化黨參多糖提取工藝的研究

胡玲玲, 吳佳財(cái)

(安康學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，陜西 安康 725000)

黨參(Codonopsis pilosula)，為《中國(guó)藥典》收錄的一味藥食同源(衛(wèi)健委發(fā)布(2018)版藥食同源目錄)、價(jià)值較高的常用中草藥，由桔梗科的黨參、川黨參等植物的根干燥而得。具有補(bǔ)氣生津，補(bǔ)脾益肺的功效[1]。黨參具有多種對(duì)人體有益的的活性成分，能抗?jié)?、抗輻射、增?qiáng)人體免疫力的作用[2,3]。黨參多糖是黨參的有效活性成分之一，多糖含量的高低能直接反映藥材質(zhì)量的優(yōu)劣。黨參多糖提取的傳統(tǒng)方法主要有為：水提-醇沉法；以及近年來(lái)發(fā)展的實(shí)驗(yàn)室使用較多的超聲波輔助提法，微波法，酶法，亞臨界法等[4,5]，對(duì)設(shè)備要求較高。本文擬采用傳統(tǒng)的水提-醇沉法，對(duì)黨參多糖進(jìn)行提取，并以提取得率為評(píng)價(jià)提取方案的指標(biāo)，結(jié)合三因素正交分析法優(yōu)化黨參多糖的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)所需主要儀器及試劑見(jiàn)表1、表2。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黨參中黨參多糖的提取 將干燥的黨參洗滌去雜、干燥處理后，切碎，用中草藥粉碎機(jī)粉碎，過(guò)24目篩，將黨參粉末加入95%乙醇加熱回流2小時(shí)進(jìn)行脫脂，趁熱抽濾，濾餅冷凍干燥，制成黨參粉末供試品。取1 g的黨參供試品粉末于100 mL圓底燒瓶，按不同的料液比加入蒸餾水，在設(shè)定的溫度下，水浴回流一段時(shí)間，趁熱抽濾，濃縮液體，加入20 mL無(wú)水乙醇，4℃下靜置24 h，黨參多糖沉淀完全，抽濾，并用乙醇、丙酮洗滌，冷凍干燥得到黨參多糖凍干品[6,7]。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備

表2 實(shí)驗(yàn)試劑

1.2.2 黨參中黨參多糖含量的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 用電子分析天平稱(chēng)取在105℃干燥至恒重的葡萄糖粉末25 mg，溶解后，轉(zhuǎn)移至250 mL的容量瓶定容，配制成的蒲萄萄溶液的濃度為100 mg·L-1。用吸量管分別移取0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL的0.1 mg·mL-1溶液于10 mL具塞比色管中，加去離子水至2 mL。再分別加入6%的苯酚1.0 mL，濃硫酸6 mL，靜置5 min，90℃水浴加熱10 min,立即冷凍至室溫。紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)300～800 nm范圍內(nèi)掃描，波長(zhǎng)在490 nm處有最大吸光度。因此，在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定多糖的吸光度[8～10]。分別以吸光度和濃度為縱、橫坐標(biāo)，得到回歸方程y=4.0114x+ 0.0989 ； R2=0.9997。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在濃度為10～60 mg·L-1的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.2.2.2 黨參提取液中黨參多糖的測(cè)定 將1.2.1提取的黨參多糖凍干品，用去離子水搖勻定容至250 mL，吸量管移取2 mL于25 mL的容量瓶中，加水至刻度線(xiàn)處。再?gòu)闹腥〕? mL溶液于比色管中加水定容至2 mL，加入6%的苯酚溶液1.0 mL，濃硫酸6 mL，靜置5 min，90℃水浴加熱10 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)其吸光度并計(jì)算出黨參多糖的提取得率。

式中：C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程所得黨參多糖濃度(mg·L-1);n為稀釋倍數(shù)； m為粉葛粉末的質(zhì)量(g)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取供試黨參粉末每份1 g，按1.2.1的提取方法進(jìn)行提取試驗(yàn)，在其他條件固定不變的的情況下，分別考察料液比(mL∶g)、回流提取時(shí)間(h)、回流溫度(℃)，以及提取次數(shù)等因素對(duì)提取得率的影響。

2.2 黨參多糖提取條件的正交設(shè)計(jì)

由文獻(xiàn)和前期的單因素實(shí)驗(yàn)的情況[11]，選擇液料比(mL∶g)、多糖提取時(shí)間(h)和提取溫度(℃)三個(gè)因素，各個(gè)因素設(shè)置三個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)分析[12,13]，因素和水平值見(jiàn)表3。

表3 黨參多糖提取實(shí)驗(yàn)因素水平

按照L9(34)正交表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)合1.2.的方法對(duì)黨參多糖進(jìn)行提取并計(jì)算提取率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析見(jiàn)表4和表5。

表4 黨參多糖提取正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)構(gòu)

表5 黨參多糖正交實(shí)驗(yàn)方差分析

由極差(R值)可知，對(duì)黨參多糖提取得率的影響因素中，A(液料比)影響最大、B(提取時(shí)間)次之、C(提取溫度)影響較小；且A2>A3>A1、B3>B2>B1、C3>C1>C2，所以黨參多糖提取最佳操作方案為A2B3C3,由表5的正交實(shí)驗(yàn)方差分析表中的F值也可得出，A因素(液料比)：FA> F0.01，B因素(提取時(shí)間)：F0.05

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

由于正交設(shè)計(jì)中的實(shí)驗(yàn)沒(méi)有A2B3C3此方案，因此需要進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證優(yōu)選出的最佳方案的是否可信。稱(chēng)取黨參粉末3份，按照優(yōu)選出的方案進(jìn)行提取并計(jì)算提取率。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 黨參多糖提取的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

表6結(jié)果顯示，在此最佳方案下提取黨參多糖，提取率分別為12.69%，12.57%和12.71%，平均提取率為12.66%,與正交設(shè)計(jì)中的方案6的提取得率接近，且RSD/%僅為0.60%，說(shuō)明優(yōu)選出的提取方案(A2B3C3，即加入黨參粉末質(zhì)量20倍的蒸餾水，在80℃的條件下回流2 h。)合理，可行。

3 討論

實(shí)驗(yàn)采用了傳統(tǒng)方法提取黨參多糖，即水提-醇沉法，通過(guò)查閱資料及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，選用液料比、提取時(shí)間和提取溫度三個(gè)因素，結(jié)合L9(34)正交表分析法對(duì)黨參多糖提取方案進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)選出的最佳的提取方案為液料比20∶1( mL∶g)，提取回流溫度80℃，回流提取時(shí)間為2 h。在此提取線(xiàn)路下，黨參多糖的提取率較高，最大值均值為12.66%。該提取線(xiàn)路簡(jiǎn)單易操作，可以為黨參多糖開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。