盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因的克隆及生物信息學(xué)分析

陳蘇維,崔鈺瑩,侯碧巍,張唯玉,魯佳佳

(安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院,陜西 安康 725000)

前言

盤基網(wǎng)柄菌是美國國立衛(wèi)生研究院公布的10種模式生物之一，正常情況下以單細(xì)胞形式生存繁殖，食物缺乏即分泌環(huán)腺苷酸(cAMP)吸引周圍單細(xì)胞匯集成多細(xì)胞 "蛞蝓(slug)"[1～2]。此單細(xì)胞和多細(xì)胞共存的生活史使其展現(xiàn)出多種表現(xiàn)型，如生長、分裂、趨光性和趨熱性等，而這些特征使得研究高等生物基因型與表現(xiàn)型間的復(fù)雜相關(guān)性變得簡(jiǎn)單且可操作性強(qiáng)[3～5]。

DJ-1最初被認(rèn)為是一種原癌基因，與人類腫瘤和癌癥發(fā)生相關(guān)，在精子的成熟和受精方面也起重要作用[6]。自從Bonifati等在帕金森病人家族內(nèi)發(fā)現(xiàn)DJ-1基因突變型，證實(shí)DJ-1也與帕金森病發(fā)生相關(guān)，且具有遺傳規(guī)律性[7]。關(guān)于DJ-1的功能和與其它基因之間的互相作用，一些學(xué)者進(jìn)行了探索[8-11]，但研究結(jié)果尚未完全闡明其作用機(jī)制，而且研究結(jié)果之間存在一定差異。本研究通過對(duì)盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析，旨在為后期利用盤基網(wǎng)柄菌模型研究DJ-1基因的功能和作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用菌株為大腸桿菌E.coliDH5α和盤基網(wǎng)柄菌D.discoideumAX2，其信息見表1。pUC18質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶EcoRI和NdeI，Taq DNA聚合酶，PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit購自上海生物工程有限公司。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株及其基因型

1.2 方法

1.2.1 盤基網(wǎng)柄菌總基因組提取 從生長克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基上收集大約107個(gè)盤基網(wǎng)柄菌細(xì)胞，2 500 r·min-1室溫離心30 s，將收集的細(xì)胞用鹽溶液沖洗4次去除殘留的克雷伯氏菌，然后用1 ml DNAzol 4 ℃放置30 min對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解。裂解液室溫12 200 r·min-1離心10 min，然后取上清液用0.5 mL 100 %酒精進(jìn)行沉淀，8 600 r·min-1離心5 min。沉淀所得DNA用1 mL 70 %酒精洗滌3次后，懸浮于100 μL 8 mM 氫氧化鈉溶液4 C 短期貯存或 -20℃長期貯存。

1.2.2 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 參照dictyBase公布的基因序列，利用Primer5.0設(shè)計(jì)DJ-1序列的特異性引物(表2)，并由Geneworks公司進(jìn)行合成。

表2 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因的上、下游引物序列

1.2.3 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因PCR擴(kuò)增 以盤基網(wǎng)柄菌總基因組DNA為模板，利用1.3合成的引物擴(kuò)增DJ-1基因全長序列。反應(yīng)體系如下：盤基網(wǎng)柄菌總基因組DNA模板 2 μL，上、下游引物(10 μM)各1 μL，Taq DNA 聚合酶 1 μL，dNTP 混合物(10 mM)2 μL，MgCl2(50 mM)5 μL，PCR 緩沖液(10 x)10 μL，ddH2O 78 μL，共100 μL。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件和參數(shù)如下：①總基因組DNA模板變性：95 C·5 min-1；②變性：95 C·1 min-1，退火：50 C ·1 min-1，延伸：72 C·2 min-1，共35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；③最后延伸：72 C·10 min-1。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物。

1.2.4 擴(kuò)增DJ-1的限制性酶切、連接、陽性克隆子篩選及酶切鑒定與測(cè)序 將PCR擴(kuò)增的DJ-1與pUC18利用EcoRI進(jìn)行限制性內(nèi)切并連接，形成連接產(chǎn)物pUC18-DJ-1。通過電穿孔法將pUC18-DJ-1轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α，利用藍(lán)-白斑法進(jìn)行轉(zhuǎn)化株篩選，獲得DJ-1陽性克隆子。利用堿裂解法從E. coli DH5α菌株中抽提pUC18-DJ-1，經(jīng)雙酶切進(jìn)行鑒定后由Geneworks公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因的生物信息學(xué)分析 用MEGA7.0軟件構(gòu)建盤基網(wǎng)柄菌DJ-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析采用自舉分析Bootstrap，設(shè)500次重復(fù)；利用Protparam軟件分析盤基網(wǎng)柄菌DJ-1的理化性質(zhì)；利用TMHMM和SignalP 4.1 Server軟件分別預(yù)測(cè)DJ-1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽；利用Predotar軟件預(yù)測(cè)DJ-1蛋白的亞細(xì)胞位置；利用SMART軟件預(yù)測(cè)DJ-1蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域；利用SOPMA和SWISS-MODEL軟件分別預(yù)測(cè)DJ-1蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因的克隆

利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DJ-1的PCR擴(kuò)增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因大小為600 bp左右，目的條帶清晰，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1A)。利用EcoRI和NdeI雙酶切驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)期相符(圖1B)。

2.2 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1的生物信息學(xué)分析

2.2.1DJ-1核苷酸同源序列比對(duì) 測(cè)序結(jié)果表明：盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因全長618 bp，不含內(nèi)含子，共編碼205 個(gè)氨基酸。將測(cè)序所得盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因序列與GenBank公布的13株不同來源DJ-1核苷酸序列進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果顯示本研究所用盤基網(wǎng)柄菌AX2菌株的DJ-1核苷酸序列與盤基網(wǎng)柄菌AX4菌株完全相同，與其同屬不同種D.purpureum相似度為69 %，而與梭菌屬10個(gè)不同菌株的相似程度介于67%～73 %之間(圖2)。

2.2.2DJ-1 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析 對(duì)本研究盤基網(wǎng)柄菌AX2的DJ-1序列和2.2.2檢索的13個(gè)同源序列采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析。結(jié)果表明：盤基網(wǎng)柄菌屬(Dictyostelium)與梭菌屬(Clostridium)形成兩個(gè)分支，盤基網(wǎng)柄菌本屬內(nèi)D.discoideum與D.purpureum兩個(gè)種親緣關(guān)系較近，而D.discoideum種內(nèi)兩個(gè)菌株AX2和AX4屬于同源(圖3)。

2.2.3DJ-1蛋白的理化性質(zhì)分析DJ-1蛋白理化性質(zhì)研究結(jié)果表明：DJ-1分子量約為22.87 kD，分子式為C1020H1616N268O311S8，其理論等電點(diǎn)為5.31。DJ-1含86個(gè)非極性氨基酸(A、F、V、L、I、P、W和M)和119個(gè)極性氨基酸，其中極性氨基酸包括28個(gè)酸性氨基酸(D和E)、26個(gè)堿性氨基酸(H、K和R)和65個(gè)中性氨基酸(N、C、Q、G、S、T和Y)。DJ-1帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為28個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)為24個(gè)，其脂溶指數(shù)(Aliphatic index)為92.20，總疏水性平均值(Grand Average of Hydropathicity, GRAVY)為-0.124，說明盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白能溶于非極性溶劑，屬于疏水性蛋白質(zhì)。盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)(instability index)為27.24(<40)，表明其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定。

2.2.4DJ-1蛋白的跨膜區(qū)、信號(hào)肽分析及結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 蛋白跨膜區(qū)及信號(hào)肽研究分析結(jié)果表明：盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白位于膜外，無跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽識(shí)別序列，也沒有明顯的結(jié)構(gòu)域。

2.2.5DJ-1蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)：盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白含α-螺旋80個(gè)，占39.02 %；β-轉(zhuǎn)角15個(gè)，占7.32 %；無規(guī)卷曲68個(gè)，占33.17 %；延伸鏈42個(gè)，占20.49%(圖4)。SWISS-MODEL預(yù)測(cè)了盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白的立體空間結(jié)構(gòu)模型(圖5)。

2.2.6DJ-1 蛋白的亞細(xì)胞定位 盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果表明：DJ-1蛋白可能位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(表3)。

表3 利用Predotar預(yù)測(cè)盤基網(wǎng)柄菌DJ-1蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞位置

3 討論

最早在意大利和荷蘭分別發(fā)現(xiàn)了DJ-114 000個(gè)堿基對(duì)缺失和L166P點(diǎn)突變引起帕金森病相關(guān)癥狀，而且其流行性具有孟德爾遺傳規(guī)律，從而證實(shí)帕金森病不是由環(huán)境變化隨機(jī)引起的生理缺陷，而是隨年齡增長而發(fā)生的神經(jīng)退行性疾病[7,12]。隨后的研究進(jìn)一步揭示DJ-1的突變可能會(huì)造成蛋白質(zhì)異常累積或磷酸化、氧化應(yīng)激和線粒體功能紊亂[13]，而其機(jī)制可能與DJ-1蛋白的亞細(xì)胞位移有關(guān)[14]，也有學(xué)者認(rèn)為DJ-1通過分子伴侶、轉(zhuǎn)錄因子或蛋白水解酶等執(zhí)行其對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用[15～17]，或者與其它疾病相關(guān)基因互相作用執(zhí)行其功能[18～19]，但其具體功能和作用機(jī)制尚不明確。

盤基網(wǎng)柄菌是一種簡(jiǎn)單的真核模式生物，其線粒體基因組和單倍體核基因組序列已被破譯[20]，且其遺傳轉(zhuǎn)化、反意義鏈或小RNA干涉基因表達(dá)、蛋白質(zhì)GFP標(biāo)記、表現(xiàn)型分析等基因操作技術(shù)已被廣泛使用，這些優(yōu)點(diǎn)使得在高等生物上無法完成的基因操作成為可能且可信度高[21～22]。

筆者研究克隆了盤基網(wǎng)柄菌的DJ-1基因，并對(duì)其進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該基因克隆成功，無序列缺失或堿基突變，具有完整的開放閱讀框。同時(shí)利用核苷酸序列進(jìn)行跨膜區(qū)域和信號(hào)識(shí)別序列分析發(fā)現(xiàn)，DJ-1沒有明顯的跨膜序列與信號(hào)肽，說明其亞細(xì)胞位置可能與線粒體無關(guān)。亞細(xì)胞位置預(yù)測(cè)認(rèn)為其可能位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，屬于較穩(wěn)定型胞內(nèi)蛋白。DJ-1蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)也發(fā)現(xiàn)了其活躍而保守的催化位點(diǎn)C117，這個(gè)位點(diǎn)與人類DJ-1蛋白質(zhì)C106相對(duì)應(yīng)。這些為今后建立盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因的原核及真核表達(dá)載體、在盤基網(wǎng)柄菌野生株內(nèi)進(jìn)行DJ-1蛋白的抑制和過表達(dá)并判斷其表達(dá)量改變與盤基網(wǎng)柄菌表現(xiàn)型之間的相關(guān)性、DJ-1亞細(xì)胞位置與細(xì)胞應(yīng)激之間的關(guān)系、C117活性位點(diǎn)的功能等奠定基礎(chǔ)。另外，盤基網(wǎng)柄菌DJ-1基因的成功克隆也為后期利用GFP標(biāo)記研究正常和氧化應(yīng)激條件下DJ-1蛋白與線粒體定位的關(guān)系、建立DJ-1基因功能和作用機(jī)制的盤基網(wǎng)柄菌模型提供理論基礎(chǔ)。