結(jié)腸腺癌患者預(yù)后相關(guān)的miRNAs影響因素分析

蔣少杰

在全球癌癥相關(guān)的死亡數(shù)目中，結(jié)腸腺癌排在第四位[1]。結(jié)腸腺癌的形成是一個復(fù)雜而漫長的過程，甚至可以達(dá)到20年。在過去的20年中，隨著早期診斷技術(shù)不斷發(fā)展，基因檢測技術(shù)的不斷完善，雖然結(jié)腸癌癥的病死率明顯降低，但是發(fā)生率依然很高[2]，新的治療手段也比較缺乏。有些研究[3-4]表明，20%～30%的結(jié)腸癌患者具有遺傳變異的性質(zhì)，其中包括基因APC和TP53在癌前病變或腺瘤的形成中起著重要的作用。目前在人類疾病與腫瘤中的非編碼基因的作用也受到很大的關(guān)注，包括miRNAs或lncRNA，這些非編碼RNA可以為結(jié)腸癌的診治和預(yù)防提供新的靶點(diǎn)及策略。microRNAs是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，主要通過抑制靶基因的功能來實(shí)現(xiàn)的。有些研究結(jié)果顯示，miRNAs是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控因子[5]。本研究中使用生物信息學(xué)方法來處理miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)都是來自于國際腫瘤數(shù)據(jù)庫(TCGA)中結(jié)腸腺癌患者，然后得到差異表達(dá)的miRNAs，探討這些表達(dá)差異的miRNAs是否與結(jié)腸腺癌患者預(yù)后有關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載 從TCGA網(wǎng)站上下載miRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)包括結(jié)腸腺癌患者組織與癌旁組織，還有相對應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)。其中男234例，年齡31～90歲，平均(67±12)歲；女217例，年齡34～90歲，平均(66±14)歲。樣本納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性結(jié)腸腺癌，術(shù)前無任何放化療經(jīng)歷；完整的臨床分期數(shù)據(jù)和預(yù)后的詳細(xì)信息。經(jīng)過分析后共計(jì)451例結(jié)腸腺癌患者納入臨床分析，臨床分期：I+II 193例，III+IV 247例，無法確定11例。M分期：M0325例，M165例，腫瘤有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無法評估(MX)54例，無法確定7例。N分期：N0263 例，N1～N2188 例。T分期：T1+T286例，T3+T4364例，原發(fā)腫瘤無法評估 1例。

1.2 數(shù)據(jù)處理 使用R語言中的limma包對miRNAs表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，得到差異表達(dá)的miRNAs。篩選標(biāo)準(zhǔn)：|log2差異倍數(shù)(FoldChange)|>1且P<0.01。

1.3 篩選與結(jié)腸腺癌患者預(yù)后相關(guān)的miRNAs 對結(jié)腸腺癌患者癌組織中多個差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行分組，根據(jù)每個miRNAs在多個樣本中的中值，大于這些中值的樣本分為高表達(dá)組，低于中值的樣本為低表達(dá)組。為了篩選出與總體生存期顯著差異相關(guān)的miRNAs，采用Kaplan-Meier生存曲線分析方法和Log-Rank檢驗(yàn)方法分別對高表達(dá)與低表達(dá)的miRNAs樣本與總體生存期(OS)的相關(guān)性進(jìn)行分析。

1.4 Cox回歸模型 采用R語言limma包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用上述的方法檢驗(yàn)各miRNAs高表達(dá)和低表達(dá)組生存率差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型來做預(yù)后分析方法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 差異表達(dá)miRNAs的篩選 應(yīng)用R語言limma包篩選出癌組織和癌旁組織差異表達(dá)的miRNAs有330個，其中上調(diào)的miRNAs有132個，下調(diào)的miRNAs有198個。癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)miRNAs的分布見圖1。

圖1 癌組織和癌旁組織差異表達(dá)的miRNAs分布火山圖

2.2 與OS相關(guān)的miRNAs篩選 根據(jù)所有樣本miRNAs的表達(dá)中位值，將分成高表達(dá)組和低表達(dá)組。采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-Rank檢驗(yàn)分析330個差異表達(dá)的miRNAs與結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果顯示，hsa-miR-326(P=0.03)、hsa-miR-92a-1(P=0.026)、hsa-miR-92a-2(P=0.012)和hsa-miR-376b(P=0.0099)與結(jié)腸腺癌患者的預(yù)后呈顯著相關(guān)。高表達(dá)hsa-miR-326與預(yù)后差顯著相關(guān)，而低表達(dá)hsa-miR-92a-1、hsa-miR-92a-2和hsa-miR-376b與預(yù)后差顯著相關(guān),見圖2。

采用多因素Cox回歸分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，差異表達(dá)的miRNAs與結(jié)腸腺癌患者的預(yù)后相關(guān),高表達(dá)hsa-miR-326(P=0.003)和低表達(dá)hsa-miR-92a-1(P=0.002)、hsa-miR-92a-2(P=0.001)和hsa-miR-376b(P=0.002)是結(jié)腸腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素,見表1。

圖2 與預(yù)后顯著相關(guān)的miRNAs的生存曲線

表1 結(jié)腸腺癌患者差異表達(dá)miRNAs的多因素Cox回歸分析

3 討 論

miRNAs是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，目前已經(jīng)證實(shí)它們廣泛存在于各種真核生物細(xì)胞內(nèi)。miRNA能完全或部分與靶基因mRNA分子的3’端非編碼區(qū)域發(fā)生堿基互補(bǔ)配對，最終抑制靶基因的表達(dá)。大量研究結(jié)果顯示，miRNAs通過染色質(zhì)重塑，組蛋白修飾和RNA代謝等多種生物學(xué)過程在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。miRNAs與多種癌癥相關(guān)[6-8]，其異常表達(dá)及突變都與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、凋亡、浸潤、遷移以及藥物的抗藥性密切相關(guān)。許多研究表明，在多種癌癥患者中，一些miRNAs表達(dá)發(fā)生改變，可作為某些癌癥或疾病診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物[9-11]。TCGA癌癥數(shù)據(jù)庫是由美國2005年發(fā)起的癌癥和腫瘤基因圖譜計(jì)劃，旨在應(yīng)用基因組分析技術(shù)研究癌癥中的基因組變化，做大規(guī)模的基因組測序，其中包含豐富的樣本類型和腫瘤類型。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)手段，篩選出來自于結(jié)腸腺癌患者的差異表達(dá)miRNAs 330個進(jìn)行預(yù)后分析、總體生存分析顯示，hsa-miR-326、hsa-miR-92a-1、hsa-miR-92a-2和hsa-miR-376b是結(jié)腸腺癌患者獨(dú)立預(yù)后的不良因素。Schaefer等[12]報(bào)道m(xù)iR-326通過上調(diào)影響小鼠結(jié)腸炎癥的發(fā)生和發(fā)展。也有研究證明，miR-326高表達(dá)影響結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和預(yù)后[13]。Ragusa等[14]證實(shí)miR-92a-1參與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡，并且影響MAPK/ERK等信號通路來導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展。也有研究發(fā)現(xiàn)，miR-92a家族以及它們的靶基因在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展起到了重要作用，包括在結(jié)腸癌中[15]。An等[16]報(bào)道，miR-376b通過直接靶向Hoxd10基因來促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移，因此它將成為乳腺癌的新型治療靶點(diǎn)和預(yù)后生物標(biāo)志物。綜上所述miRNAs可能參與結(jié)腸腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，在結(jié)腸腺癌惡性進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論

本研究對TCGA中結(jié)腸腺癌患者大數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出與結(jié)腸腺癌預(yù)后顯著相關(guān)的hsa-miR-326、hsa-miR-92a-1、hsa-miR-92a-2和hsa-miR-376b。本研究結(jié)果提示上述miRNAs分別與各臨床參數(shù)存在顯著相關(guān)性，可能為結(jié)腸腺癌機(jī)制的研究提供理論依據(jù)，為尋找結(jié)腸腺癌診斷和預(yù)后新的分子標(biāo)志物以及個性化治療方案提供新的思路。