穴位中頻脈沖電刺激對(duì)下頜前伸大鼠咬肌改建的生理與生化研究

陳青青 劉珍巧 王豫蓉

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科 口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重慶 401147

穴位中頻脈沖電刺激是通過電刺激相關(guān)穴位的治療方法，可增強(qiáng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)興奮性，使局部組織血液循環(huán)和代謝功能加快[3]，促進(jìn)肌肉功能的恢復(fù)，且具有作用深度大、無痛、不易產(chǎn)生適應(yīng)性、對(duì)皮膚無損傷等特點(diǎn)。目前穴位中頻脈沖電刺激治療主要應(yīng)用于運(yùn)動(dòng)員肌肉訓(xùn)練、肌肉損傷后理療以及神經(jīng)肌肉系統(tǒng)疾病的康復(fù)治療，還少見應(yīng)用于口腔臨床功能矯治過程中的報(bào)道。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotropic factor，BDNF）是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，在骨骼肌改建中起著重要作用[4-5]。本實(shí)驗(yàn)建立了下頜前伸動(dòng)物模型，給予咬肌頰車穴中頻脈沖電刺激，并對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的咬肌肌電變化與BDNF表達(dá)進(jìn)行觀察，旨在了解穴位中頻脈沖電刺激對(duì)下頜前伸大鼠咬肌改建的影響，以探討穴位中頻脈沖電刺激應(yīng)用于功能矯治的可能性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選用4周齡雄性Sprague-Dawley大鼠60只為研究對(duì)象，大鼠體質(zhì)量（70±5.27） g，均購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前均自由飲水，定時(shí)攝食。按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)原則將60只大鼠分為3個(gè)大組（實(shí)驗(yàn)組、條件對(duì)照組和空白對(duì)照組），每個(gè)大組根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀測天數(shù)又隨機(jī)分為4個(gè)小組（3、7、14、21 d組），共12組，每組5只。各組的處理方式如下：1）實(shí)驗(yàn)組，戴用前導(dǎo)下頜裝置且接受穴位中頻脈沖電刺激；2）條件對(duì)照組，戴用前導(dǎo)下頜裝置，不接受穴位中頻脈沖電刺激；3）空白對(duì)照組，不戴用前導(dǎo)下頜裝置且不接受穴位中頻脈沖電刺激。

1.2 主要儀器與試劑

前導(dǎo)下頜裝置參照Rabie等[6]使用的矯治器裝置制作，由底板、斜面導(dǎo)板兩部分組成。斜面導(dǎo)板與上頜咬合平面呈20°～25°，底板和斜面導(dǎo)板均使用甲基丙烯酸甲酯樹脂制成。黏固劑采用GC Fuji Ⅸ玻璃離子黏固劑（蘇州而至齒科有限公司）。ZM-C-IA型中頻治療儀（廊坊市天月醫(yī)療器械有限公司），BL-420F生物信號(hào)采集與分析儀（成都泰盟軟件有限公司），兔抗鼠BDNF（重慶蒙博生物科技有限公司），SABC試劑盒及DAB顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），顯微病理圖文分析系統(tǒng)（奧林巴斯公司，日本），總RNA提取試劑盒（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司），qRT-PCR Synthesis試劑盒、2×RealStar Green Fast Mixture（北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司），Z223MK-2低溫離心機(jī)（Hermle公司，德國），C-1000型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.3 建立下頜前伸動(dòng)物模型以及明確中頻脈沖電刺激方式

使用玻璃離子黏固劑將自制的前導(dǎo)下頜裝置黏固于條件對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠的上切牙上，戴用自制頸圈防止大鼠前爪干擾矯治器。根據(jù)中國針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸分會(huì)制定的《動(dòng)物針灸穴位圖譜》，頰車穴定位于下頜角前上方咬肌最豐隆處的中點(diǎn)（圖1）。使用電推刀去除大鼠雙側(cè)頰車穴周圍的毛發(fā)，用75%乙醇棉球清潔待測部位。將大鼠固定于大鼠固定器上，將中頻電治療儀的兩個(gè)電極片分別置于實(shí)驗(yàn)組大鼠雙側(cè)頰車穴表面皮膚，醫(yī)用膠帶固定電極片。開啟中頻電治療儀，選擇刺激模式9（神經(jīng)肌肉刺激模式），波形選擇正弦波，調(diào)制頻率選擇0～150 Hz，中頻電頻率選擇2 000～8 000 Hz，刺激強(qiáng)度選擇1檔。每天定時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行中頻脈沖電刺激，刺激時(shí)間設(shè)定為15 min，實(shí)驗(yàn)各組大鼠分別刺激3、7、14、21 d。

圖1 頰車穴定位Fig 1 Acupuncture point positioning

1.4 肌電測量與處理

各組大鼠分別于實(shí)驗(yàn)3、7、14、21 d時(shí)行肌電測量，其中實(shí)驗(yàn)組的肌電測量在中頻脈沖電刺激結(jié)束30 min后進(jìn)行。測量時(shí)將大鼠固定于大鼠固定器上，將BL-420F生物信號(hào)采集與分析儀的正極置于大鼠左側(cè)頰車穴皮膚，負(fù)極置于大鼠右側(cè)頰車穴皮膚，地極置于大鼠背部皮膚，電極片使用醫(yī)用膠帶固定。記錄大鼠靜息狀態(tài)咬肌肌電1 min，肌電記錄完成后，涂布甘油以保護(hù)測量部位的皮膚。應(yīng)用BL-420F生物技能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)軟件對(duì)原始肌電信號(hào)進(jìn)行平滑處理，每只大鼠隨機(jī)截取3個(gè)單位時(shí)長為2 s的肌電記錄，記錄積分肌電并取平均值。按以上方法得到各組大鼠在實(shí)驗(yàn)各階段靜息狀態(tài)下的咬肌平均肌電微分值。

1.5 標(biāo)本制備

分別于實(shí)驗(yàn)3、7、14、21 d肌電測量完成后斷頸處死各空白對(duì)照組、條件對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠。取大鼠左側(cè)咬肌置于新鮮配置的4%多聚甲醛溶液中，4 ℃固定12 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。每塊咬肌組織作連續(xù)切片5張，切片厚度為4 μm，1張用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，其余4張用于SABC免疫組織化學(xué)染色。取大鼠右側(cè)咬肌組織置于凍存管，快速轉(zhuǎn)移至液氮罐中，用于后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測。

1.6 HE染色

取各組咬肌組織標(biāo)本切片，常規(guī)脫蠟、水化，經(jīng)蘇木精染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色、梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.7 BDNF免疫組織化學(xué)染色

取各組咬肌組織標(biāo)本切片，常規(guī)脫蠟、水化，H2O2孵育以阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶的活性，檸檬酸鈉緩沖液浸泡，微波修復(fù)暴露抗原，滴加BSA封閉液（牛血清白蛋白），加入一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗，37 ℃孵育30 min，再滴加SABC，37 ℃孵育30 min，DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染，脫水封片。切片置于光學(xué)顯微鏡下觀察，利用顯微病理圖文分析系統(tǒng)測定大鼠咬肌BDNF陽性染色部分的光密度值，每張組織切片隨機(jī)選取4個(gè)視野進(jìn)行積分光密度值（integrated optical density，IOD）測量，結(jié)果取其平均值。

1.8 qRT-PCR檢測BDNF mRNA表達(dá)

取各組右側(cè)咬肌組織適量，經(jīng)研磨、勻漿，使用RNA快速提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測其純度，OD260/OD280值為1.9～2.1說明純度較好。純度符合要求后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行qRTPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系按說明書進(jìn)行，引物序列見表1，引物的合成與設(shè)計(jì)均由美國Invitrogen公司完成。

表1 qRT-PCR引物序列Tab 1 The primer sequence for qRT-PCR

本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件為：解鏈95 ℃ 1 min，退火95 ℃ 5 s，延伸57 ℃ 10 s，最后延伸60 ℃ 34 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。結(jié)果分析采用2-ΔΔCT法。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究使用Graphpad prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用雙因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肌電檢測結(jié)果

各組大鼠的咬肌靜息肌電的變化圖見圖2，積分肌電值見表2。

圖2 各組大鼠下頜姿勢位咬肌靜息肌電變化Fig 2 Resting electromyographic changes of the masseter muscle in the mandibular advancement in different groups

表2 各組大鼠下頜姿勢位咬肌靜息積分肌電值Tab 2 Resting electromyographic of the masseter muscle in the mandibular advancement in different groups μV·ms-1,±s, n=5

表2 各組大鼠下頜姿勢位咬肌靜息積分肌電值Tab 2 Resting electromyographic of the masseter muscle in the mandibular advancement in different groups μV·ms-1,±s, n=5

注：a與空白對(duì)照組比較P＜0.05；b與條件對(duì)照組比較P＜0.05。

戴入時(shí)間 空白對(duì)照組 條件對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組戴入前 143.81±5.20 147.71±4.27 150.61±2.41戴入當(dāng)時(shí) 149.40±5.83 214.71±4.79a 241.13±6.85ab戴入3 d 142.43±7.65 202.67±5.89a 228.40±7.58ab戴入7 d 149.99±2.13 188.16±3.92a 204.66±6.89ab戴入14 d 144.44±5.46 178.74±3.65a 166.43±5.03ab戴入21 d 148.59±3.15 175.49±2.65a 155.11±7.44b

由圖2和表2可見，不同的觀測時(shí)間內(nèi)，空白對(duì)照組大鼠下頜姿勢位時(shí)咬肌靜息肌電的波動(dòng)很小，條件對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠下頜姿勢位時(shí)咬肌的靜息肌電在實(shí)驗(yàn)各期均先升高后降低。條件對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠戴入矯治器當(dāng)時(shí)咬肌肌電活動(dòng)明顯高于戴入前，且實(shí)驗(yàn)組高于條件對(duì)照組（P<0.05）；矯治器戴入3 d，條件對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠咬肌肌電均較戴入當(dāng)時(shí)明顯降低，但仍高于戴入前水平；戴入14 d，實(shí)驗(yàn)組肌電活動(dòng)較條件對(duì)照組明顯降低（P<0.05）；戴入21 d，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組的肌電活動(dòng)水平無明顯差異（P>0.05），均低于條件對(duì)照組（P<0.05）。

2.2 HE染色結(jié)果

各組大鼠咬肌的HE染色見圖3，各組標(biāo)本均未見炎癥細(xì)胞浸潤。在各實(shí)驗(yàn)階段，空白對(duì)照組咬肌肌纖維粗細(xì)較均勻，排列整齊、緊密，肌核形態(tài)較規(guī)則，多呈長橢圓形，位置分布較均勻，位于肌纖維邊緣。條件對(duì)照組在戴入7、14 d時(shí)出現(xiàn)咬肌肥大改變，表現(xiàn)為細(xì)胞核增多，排列紊亂，出現(xiàn)核內(nèi)移現(xiàn)象，肌纖維增粗，肌纖維間的間距減小；戴入21 d時(shí)，細(xì)胞核數(shù)量和肌纖維直徑較14 d時(shí)有所減少，細(xì)胞核排列較規(guī)則。實(shí)驗(yàn)組在戴入7 d時(shí)出現(xiàn)咬肌增生肥大的表現(xiàn)，肌纖維增粗，細(xì)胞核增多，排列紊亂；戴入14 d時(shí)，細(xì)胞核數(shù)量有所減少；戴入21 d時(shí)，細(xì)胞核數(shù)量進(jìn)一步減少，細(xì)胞核數(shù)量與空白對(duì)照組基本一致，但排列較空白對(duì)照組紊亂，仍有少許核內(nèi)移現(xiàn)象。與條件對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組戴入3、7 d時(shí)的細(xì)胞核數(shù)量無明顯增多；戴入14 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核有所減少；戴入21 d時(shí)，細(xì)胞核數(shù)量進(jìn)一步減少。

圖3 各組大鼠下頜姿勢位時(shí)咬肌的組織學(xué)變化 HE × 400Fig 3 Histological changes of masseter muscle in the mandibular advancement in different groups HE × 400

2.3 BDNF免疫組織化學(xué)結(jié)果

各組大鼠咬肌纖維BDNF的免疫組織化學(xué)染色見圖4，BDNF陽性表達(dá)呈黃褐色。各組BDNF染色的IOD值結(jié)果見表3。條件對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠咬肌BDNF表達(dá)在實(shí)驗(yàn)過程中均呈先升高后降低的趨勢。與空白對(duì)照組比較，條件對(duì)照組在7、14、21 d時(shí)咬肌纖維BDNF陽性染色加深，實(shí)驗(yàn)組3、7、14 d時(shí)咬肌纖維BDNF陽性染色加深，實(shí)驗(yàn)組21 d時(shí)的IOD值與空白對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與條件對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組3 d時(shí)BDNF陽性染色加深，7 d時(shí)兩組無明顯差異，14 d和21 d時(shí)BDNF蛋白表達(dá)降低（P<0.05）。

圖4 各組大鼠咬肌BDNF蛋白的表達(dá)變化 SABC × 400Fig 4 Changes of expression of BDNF protein in masseter muscle in different groups SABC × 400

表3 大鼠咬肌BDNF蛋白的IOD測量值變化Tab 3 Changes of the IOD of BDNF protein in masseter muscle ±s, n=5

表3 大鼠咬肌BDNF蛋白的IOD測量值變化Tab 3 Changes of the IOD of BDNF protein in masseter muscle ±s, n=5

注：a與空白對(duì)照組比較P<0.05；b與條件對(duì)照組比較P<0.05。

戴入時(shí)間/d 空白對(duì)照組 條件對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組3 158.16±15.64 167.50±5.96 183.69±16.88ab 7 156.49±12.22 225.20±10.54a 213.43±9.49a 14 150.53±6.94 229.14±9.68a 196.45±13.11ab 21 149.33±5.64 200.93±20.25a 155.63±10.09b

2.4 qRT-PCR結(jié)果

大鼠咬肌組織提取出的RNA經(jīng)測定，其OD260/OD280值均在1.9～2.1之間，純度符合要求。BDNF mRNA的qRT-PCR結(jié)果見表4。條件對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組BDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。與空白對(duì)照組比較，條件對(duì)照組BDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量在戴入7、14、21 d時(shí)明顯升高（P＜0.05），實(shí)驗(yàn)組在戴入3、7、14 d時(shí)明顯升高（P＜0.05），戴入21 d時(shí)與空白對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05）；與條件對(duì)照組相比較，實(shí)驗(yàn)組在戴入3 d時(shí)BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），7、14 d時(shí)無明顯差異（P＞0.05），21 d時(shí)相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）。

3 討論

正畸臨床上對(duì)處在生長發(fā)育期的安氏Ⅱ類患者，常使用功能矯治器前導(dǎo)下頜以刺激下頜生長，改善患者面型[7]。采用功能矯治器前伸下頜后，一方面使髁突在關(guān)節(jié)窩內(nèi)向前下方向移位，使生長活躍的髁突所受壓力減?。涣硪环矫媸瓜嚓P(guān)肌肉牽張，肌肉被動(dòng)牽張產(chǎn)生的力傳遞到牙齒、牙弓和頜骨上[8]，將功能過度或功能不足的肌肉導(dǎo)向正常；同時(shí)相關(guān)咀嚼肌發(fā)生適應(yīng)性改建，維持下頜骨在新的姿勢位的穩(wěn)定性[9]。Sood等[2]研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)肌肉完成適應(yīng)性改建通常需要2年左右時(shí)間，而功能矯治的時(shí)間通常為1年左右。由于神經(jīng)肌肉改建速度較慢，導(dǎo)致功能矯治結(jié)束后神經(jīng)肌肉平衡尚未建立，肌肉等軟組織可使前伸的下頜骨產(chǎn)生功能性回退，這是造成功能矯治遠(yuǎn)期效果不穩(wěn)定的主要因素[10]。Vardimon等[11]提出延長功能矯治器戴用時(shí)間，以彌補(bǔ)戴用傳統(tǒng)功能矯治器神經(jīng)肌肉適應(yīng)差的特點(diǎn)。但延長矯治器戴用時(shí)間會(huì)降低患者的依從性，導(dǎo)致矯治效果不佳，且過長時(shí)間戴用功能矯治器會(huì)影響兒童的正常生長發(fā)育。電刺激通過引入動(dòng)作電位以促進(jìn)失功能神經(jīng)恢復(fù)生物電活動(dòng)[12]，可在肌肉組織中產(chǎn)生電阻性發(fā)熱，增加二磷酸腺苷、三磷酸腺苷等代謝產(chǎn)物釋放，引起血管活性介質(zhì)增加，有調(diào)節(jié)肌纖維生理、生化性質(zhì)，維持肌肉的體積和肌力，促進(jìn)萎縮肌肉纖維再生，改善肌肉組織代謝，促進(jìn)血液循環(huán)，緩解肌肉疲勞，治療運(yùn)動(dòng)性肌肉損傷，快速消腫等作用[13-14]。在諸多電刺激方式中，調(diào)制中頻脈沖電刺激兼有低頻電與中頻電的特點(diǎn)，其療效較單一的低頻電治療和中頻電治療更好[15]。調(diào)制中頻脈沖電刺激優(yōu)點(diǎn)包括：1）幅度、波形不斷變化，機(jī)體不易產(chǎn)生適應(yīng)性；2）作用深度大；3）無電解作用，對(duì)皮膚無損傷。頜面部肌肉中，咬肌與咀嚼功能密切相關(guān)且力量強(qiáng)大，是影響下頜骨位置移動(dòng)以及移動(dòng)后復(fù)發(fā)的主要因素。頰車穴在解剖學(xué)上為咬肌覆蓋，周圍分布有下頜神經(jīng)、面神經(jīng)下頜緣支等。該穴位區(qū)域的神經(jīng)、肌肉數(shù)量多且復(fù)雜，與下頜運(yùn)動(dòng)關(guān)系非常密切[16]。臨床上，頰車穴常用作治療面癱、顳下頜關(guān)節(jié)疼痛的常選穴位，通過針灸或者電刺激等方式作用于頰車穴，有緩解咀嚼肌痙攣，減輕神經(jīng)肌肉疼痛，促進(jìn)局部血液循環(huán)，改善面部神經(jīng)肌肉功能等作用[17-18]。

本研究選用處于生長發(fā)育高峰期的4周齡雄性大鼠，利用調(diào)制中頻脈沖電刺激實(shí)驗(yàn)組大鼠的頰車穴，分別在戴用功能矯治器前，戴入當(dāng)時(shí)和戴用后3、7、14、21 d時(shí)測量其咬肌靜息肌電值，觀察咬肌組織結(jié)構(gòu)，檢測BDNF蛋白表達(dá)情況，探討穴位中頻脈沖電刺激是否能促進(jìn)肌肉改建。

肌電圖是臨床上檢查肌肉功能常用的無創(chuàng)方法[19]。肌電是骨骼肌在興奮時(shí)因肌纖維動(dòng)作電位傳導(dǎo)和擴(kuò)布發(fā)生的電位變化，是肌肉中許多運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢辉跁r(shí)間和空間上的疊加。表面肌電信號(hào)是通過表面電極引導(dǎo)、記錄的肌電變化，能夠在非損傷狀態(tài)下定量反應(yīng)肌肉功能狀態(tài)。有研究[20]表明，積分肌電與肌力成正比關(guān)系，能很好地反映肌肉的功能狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，戴入矯治器前，各組大鼠咬肌在姿勢位時(shí)存在輕微肌電活動(dòng)，這是由于姿勢位時(shí)下頜骨因重力作用有向后下方向旋轉(zhuǎn)的傾向，咬肌通過輕微收縮參與維持大鼠下頜姿勢位的穩(wěn)定?？瞻讓?duì)照組咬肌姿勢位肌電水平在實(shí)驗(yàn)各期無明顯變化，說明咬肌功能受自然生長因素很小。條件對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠戴入矯治器當(dāng)時(shí)肌電活動(dòng)增強(qiáng)，可能是由于矯治器前伸下頜，且增加了頜間垂直高度，咬肌受到牽拉，刺激牽張感受器，使其收縮活動(dòng)增加，同時(shí)，肌肉張力性活動(dòng)增加也有利于下頜前伸位的維持。電刺激與中樞神經(jīng)發(fā)出沖動(dòng)所引起的肌肉收縮效果是一樣的，實(shí)驗(yàn)組瞬時(shí)肌電高于對(duì)照組，可能是由于穴位中頻電刺激咬肌后，短時(shí)間內(nèi)調(diào)動(dòng)了更多的肌纖維參與收縮，肌肉收縮活動(dòng)增加所致。條件對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組在戴入3、7 d時(shí)，咬肌靜息肌電逐漸降低，說明咬肌處于功能改建狀態(tài)，正逐漸適應(yīng)下頜前伸位；戴入21 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組咬肌肌電與對(duì)照組無明顯差異，較條件對(duì)照組咬肌肌電水平低，提示實(shí)驗(yàn)組大鼠較條件對(duì)照組大鼠更快適應(yīng)了新的下頜位置，初步建立了新的功能平衡，并且通過適當(dāng)?shù)募‰娝?，維持下頜在新的前伸姿勢位的穩(wěn)定。

肌肉受到適宜刺激可引起生理性活動(dòng)增強(qiáng)，肌纖維肥大以及衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量增多，衛(wèi)星細(xì)胞加入到肌纖維中增加肌核量，表現(xiàn)為肌核內(nèi)移，又稱中央核現(xiàn)象，常見于代償性肥大的肌纖維中。本實(shí)驗(yàn)過程中，條件對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均先發(fā)生代償性肥大，然后組織形態(tài)學(xué)慢慢恢復(fù)至大致正常。條件對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠在下頜前伸第7天時(shí)肌纖維出現(xiàn)增生肥大表現(xiàn)，表現(xiàn)為肌纖維橫截面積增大，肌纖維間的間距減小，細(xì)胞核增多，排列紊亂，并出現(xiàn)中央核現(xiàn)象，說明條件對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠咬肌功能增強(qiáng)，肌纖維代償性肥大以適應(yīng)新的下頜前伸位置。前伸14 d時(shí)，條件對(duì)照組大鼠肌纖維細(xì)胞核數(shù)量與前伸7 d時(shí)無明顯差異，實(shí)驗(yàn)組較前伸7 d天時(shí)肌纖維細(xì)胞核數(shù)量有所減少，中央核現(xiàn)象減少，說明實(shí)驗(yàn)組大鼠咬肌功能活動(dòng)開始減弱，開始適應(yīng)新的下頜前伸位置；實(shí)驗(yàn)組21 d時(shí)細(xì)胞核數(shù)量基本與空白對(duì)照組一致，但排列仍較紊亂，有少許核內(nèi)移現(xiàn)象，條件對(duì)照組細(xì)胞核數(shù)量仍較多，排列紊亂，說明實(shí)驗(yàn)組大鼠咬肌活動(dòng)進(jìn)一步減弱，比條件對(duì)照組更好地適應(yīng)新的下頜前伸位置，但仍處于適應(yīng)改建過程中，未完全適應(yīng)，可能仍需一段時(shí)間，才能形成穩(wěn)定的肌肉結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定新的下頜前伸位。

肌肉運(yùn)動(dòng)的最小功能單元稱為運(yùn)動(dòng)單元，由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與其支配的肌肉纖維組成，二者之間的信息傳遞依賴神經(jīng)肌肉接頭（neuromuscular junction，NMJ）。NMJ通過將神經(jīng)元傳出的電信號(hào)轉(zhuǎn)化為化學(xué)信號(hào)，引起肌肉收縮，在肌肉的功能運(yùn)動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用。BDNF可由肌纖維產(chǎn)生，是重要的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，有促進(jìn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活、增強(qiáng)突觸傳遞效率、維持神NMJ的發(fā)育和功能等作用[4-5]，在骨骼肌改建中起著重要作用。肌肉收縮可增加骨骼肌內(nèi)BDNF的表達(dá)，BDNF表達(dá)升高可作為肌肉改建活躍的指標(biāo)[21]。本研究顯示，空白對(duì)照組咬肌纖維BDNF表達(dá)逐漸降低，可能與軟食喂養(yǎng)有關(guān)。由于進(jìn)食軟食，大鼠咀嚼次數(shù)與時(shí)間減少，咬肌功能活動(dòng)減弱，從而影響了BDNF表達(dá)。條件對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠在為期21 d的實(shí)驗(yàn)階段內(nèi)，BDNF表達(dá)都呈先上升后下降的趨勢。實(shí)驗(yàn)前階段BDNF表達(dá)水平上升提示咬肌為適應(yīng)驟然改變的下頜位置，NMJ突觸活動(dòng)增強(qiáng)，改建速度逐漸加快；實(shí)驗(yàn)后階段BDNF表達(dá)水平下降說明隨著大鼠逐漸適應(yīng)下頜前伸位，NMJ突觸活動(dòng)逐漸減弱，改建速度放緩；當(dāng)BDNF表達(dá)水平恢復(fù)至與空白對(duì)照組大鼠基本一致時(shí)，說明NMJ突觸活動(dòng)水平已恢復(fù)至正常，咬肌改建基本完成。與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠咬肌BDNF表達(dá)在下頜前伸3 d時(shí)明顯升高，條件對(duì)照組大鼠無明顯差異，說明與單獨(dú)下頜前伸比較，穴位中頻電刺激組在戴用功能矯治器的早期即可進(jìn)入活躍的改建期。在實(shí)驗(yàn)7、14 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠咬肌BDNF表達(dá)水平較條件對(duì)照組大鼠低，提示實(shí)驗(yàn)組大鼠通過前期的高速改建，已逐漸適應(yīng)新的下頜位置，改建速度由之放緩，而條件對(duì)照組大鼠尚未很好適應(yīng)新的下頜位置，仍處于高速改建過程中。此外，也可能由于條件對(duì)照組大鼠改建上升期更長，導(dǎo)致BDNF表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)后階段較實(shí)驗(yàn)組大鼠更高。在實(shí)驗(yàn)21 d時(shí)，與空白對(duì)照組比較，條件對(duì)照組BDNF表達(dá)水平仍較高，而實(shí)驗(yàn)組BDNF表達(dá)水平則無明顯差異，說明實(shí)驗(yàn)組咬肌肌肉改建已近完成，而條件對(duì)照組肌肉改建仍在進(jìn)行，改建尚未完成。在實(shí)驗(yàn)后階段，雖然條件對(duì)照組大鼠BDNF長時(shí)間處于高水平表達(dá)，但其完成改建的時(shí)間卻較實(shí)驗(yàn)組更長。這也說明在不加干預(yù)的情況下，下頜前伸后，咬肌完成改建過程需要較長的時(shí)間，影響臨床功能矯治的療效和保持；穴位中頻脈沖電刺激縮短了咬肌完成改建的時(shí)間，可能對(duì)縮短患者矯治療程，更好保持矯治效果有積極作用。

本研究結(jié)果表明，中頻脈沖電刺激作用于下頜前伸大鼠頰車穴可早期加強(qiáng)咬肌的肌電活動(dòng)，上調(diào)BDNF的表達(dá)，縮短咬肌肌電和BDNF水平恢復(fù)至正常的時(shí)間，促進(jìn)肌肉組織完成改建，且其操作簡單，安全舒適，有望成為功能矯治的輔助療法，但其原理及具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。