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    擬黃花烏頭中生物堿的殺蟲活性研究

    2020-11-11 12:51:42范丹麗楊玲玲曾東強(qiáng)唐文偉
    環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào) 2020年5期
    關(guān)鍵詞:白背飛虱粗提物飛虱

    范丹麗,楊玲玲,曾東強(qiáng),唐文偉

    (廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院,廣西農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧 530005)

    擬黃花烏頭AconitumanthoroideumDC.,毛茛科Ranunculaceae烏頭屬Aconitum,多年生草本植物,分布于阿爾泰山脈,新疆特有植物。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,烏頭屬植物的藥用價(jià)值被廣泛研究,其天然產(chǎn)物的生物活性也得到了越來(lái)越全面的發(fā)掘。關(guān)于烏頭屬的生物活性報(bào)道其主要作用成分為二萜類生物堿(徐漢虹, 2004;楊麗華, 2016;尹田鵬, 2016),其在臨床醫(yī)學(xué)方面研究較多,謝艷芳從制黃草烏中分離得到具有抗人卵巢腺癌細(xì)胞SK-OV-3、人肺癌細(xì)胞A549、人宮頸癌細(xì)胞Hela活性的化合物(謝艷芳, 2015),蔣瑩從毛果吉林烏頭中分離得到9個(gè)二菇生物堿化合物,其中Delcosine(1),Tuguaconitine(2),Denudatine(3)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用,Delcosine(1),Tuguaconitine(2),Lepenine(5),11 a-hydroxy lepenine(6),JiYuan-Aconitine(7)具有抗人前列腺癌細(xì)胞PC-3的作用(蔣瑩, 2010),海力馬依·海米提等從烏頭屬植物中分離得到對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela細(xì)胞、人肺腺癌細(xì)胞A549細(xì)胞株具有細(xì)胞毒活性的生物堿(海力馬依·海米提, 2016)。烏頭屬植物在農(nóng)業(yè)上的生物活性也有一些研究,顧地周等人發(fā)現(xiàn)高山烏頭、北烏頭、黃花烏頭長(zhǎng)白山3種烏頭屬植物的水蒸氣蒸餾液對(duì)大豆莢螟、大螟、玉米螟有觸殺活性(顧地周, 2011),陳琳在展毛大渡烏頭和毛序準(zhǔn)喝爾烏頭中發(fā)現(xiàn)aconitine、pubescensine、3-deoxyaconitine和chasmanthinine (EC50≤ 0.07 mg/cm)對(duì)甜菜夜蛾幼蟲有顯著拒食作用(陳琳, 2017)。擬黃花烏頭天然產(chǎn)物成分近年來(lái)研究較多,張吉發(fā)從擬黃花烏頭中共分離鑒定了22個(gè)二萜生物堿,發(fā)現(xiàn)化合物Nominine對(duì)MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y慢性損傷細(xì)胞有較弱保護(hù)性(張吉發(fā), 2018),但鮮見擬黃花烏頭在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的生物活性報(bào)道。

    本研究發(fā)現(xiàn)擬黃花烏頭的甲醇粗提物對(duì)褐飛虱、白背飛虱具有顯著的觸殺活性,為明確其觸殺活性成分,基于活性跟蹤對(duì)其進(jìn)行天然產(chǎn)物分離,以期為開發(fā)擬黃花烏頭提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1供試植物

    擬黃花烏頭AconitumanthoroideumDC.,全草,2006年采自新疆石河子,由廣西林業(yè)勘察設(shè)計(jì)研究院鐘業(yè)聰研究員鑒定。

    1.1.2供試?yán)ハx

    褐飛虱NilaparvatalugensSt?l:從田間采集褐飛虱成蟲或若蟲400頭,放在網(wǎng)室中用分孽期至孕穗期的TN1水稻品種飼養(yǎng)1~2代,待其種群繁殖到足夠的數(shù)量時(shí),用長(zhǎng)翅成蟲作為供試?yán)ハx。

    白背飛虱SogatellafurciferaHorvath:從田間采集白背飛虱成蟲或若蟲400頭,飼養(yǎng)方法同褐飛虱,用長(zhǎng)翅成蟲作為供試?yán)ハx。

    Tn5B1-4(Trichoplusiani)為粉紋夜蛾卵巢細(xì)胞,引自華中師范大學(xué),由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為27±1℃,無(wú)需CO2,在單層細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿整個(gè)瓶底時(shí),用吸管輕輕吹打成細(xì)胞懸液,以1 ∶3的比例傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)基為Grace’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基,加適量酵母提取物、水解乳蛋白,用超純水溶解。完全培養(yǎng)基按9%的比例加入新生牛血清即可。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1植物粗提物的提取

    采用冷浸法提取,將采集的植物材料放在室內(nèi)通風(fēng)處陰干,再在50℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)充分干燥,用植物粉碎機(jī)粉碎。將材料干粉(2.0 kg)裝入大型溶劑桶內(nèi)(10 kg),加入甲醇,溶劑比為5 ∶1(v/m),期間間斷搖晃溶劑桶,每次提取72 h,重復(fù)提取3次,合并濾液用大型濃縮儀減壓濃縮,得到甲醇粗提物(30 g),置于冰箱中備用。

    1.2.2植物材料生物活性成分的分離

    以活性跟蹤為基礎(chǔ),確定活性部位,綜合應(yīng)用硅膠柱層析、MCI柱層析、Sephadex LH-20、HPLC制備等方法對(duì)甲醇粗提物分離純化,得到化合物。

    1.2.3結(jié)構(gòu)鑒定

    核磁共振譜(NMR)測(cè)定:以氘代試劑為溶劑,四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo),測(cè)定1H NMR、13C NMR和必要的2D NMR;質(zhì)譜(MS)測(cè)定:采取EI源、ESI源測(cè)定。根據(jù)MS圖譜分析判斷出化合物的分子量,由核磁共振譜推測(cè)C、H原子數(shù)及相關(guān)基團(tuán),結(jié)合二者的情況推測(cè)出化合物的結(jié)構(gòu),然后通過(guò)比對(duì)文獻(xiàn),鑒定出化合物的結(jié)構(gòu),并進(jìn)行波譜數(shù)據(jù)的歸屬。

    1.2.4生物活性測(cè)定

    1.2.4.1 褐飛虱的生物活性測(cè)定

    采用毛細(xì)管微量點(diǎn)滴法。先用丙酮或甲醇將植物甲醇粗提物或化合物溶解,再用丙酮配成所需濃度的藥液。從網(wǎng)室中采回2~5日齡的褐飛虱長(zhǎng)翅成蟲,雌雄蟲分開采集和測(cè)定,用CO2氣體麻醉后,用毛細(xì)管將0.09239 μL或0.1164 μL藥液(對(duì)照用相應(yīng)溶劑)點(diǎn)滴在蟲體的前胸背板上。每種藥劑共點(diǎn)滴90頭蟲左右,重復(fù)3次。處理過(guò)的試蟲待蘇醒后放入自制的養(yǎng)蟲籠中,每個(gè)養(yǎng)蟲籠放蟲約30頭。養(yǎng)蟲籠是用聚酯薄膜制成的高14 cm、直徑7 cm的圓筒,圓筒下部用海綿塞堵住,上部用紗布封口,籠中放2支TN1稻莖,稻莖穿過(guò)海綿塞剪口浸入罐頭瓶的水中。將養(yǎng)蟲籠連同盛水的罐頭瓶放進(jìn)溫度25±1℃,相對(duì)濕度75%~85%,每日光照16 h的光照培養(yǎng)箱中,分別于24 h、48 h檢查死蟲數(shù)。計(jì)算死亡率(Fujieetal., 1987;Yechengetal., 2005;Wenweietal., 2009)。校正死亡率按公式:校正死亡率(%)=(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(1-對(duì)照組死亡率)×100。

    1.2.4.2化合物的細(xì)胞毒性測(cè)定

    藥液配制:用少量丙酮或二甲基亞砜(DMSO)將供試化合物溶解后配成母液,在超凈工作臺(tái)上以0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌,并用含1% DMSO的培養(yǎng)基分別將藥劑配成試驗(yàn)所需濃度,丙酮最終濃度為2.5%,DMSO最終濃度為1%。以含1% DMSO或2.5%丙酮的培養(yǎng)基為對(duì)照。

    MTT(methylthiazoletrazolium)溶液配制:稱取50.0 mg MTT,加入10 mL三蒸水培養(yǎng)基,待完全溶解后過(guò)濾,此時(shí)MTT溶液的濃度為5 mg/mL,置于4℃冰箱中備用。

    測(cè)試方法為MTT法(Fickovaetal., 2008;Zhangli, 2008):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SL細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔加入100 μL,培養(yǎng)24 h,將培養(yǎng)板翻轉(zhuǎn)倒出培養(yǎng)液,每孔加入100 μL相應(yīng)濃度的藥液,繼續(xù)培養(yǎng)20 h、44 h,即測(cè)定前4 h加入MTT母液10 μL并輕微震蕩,放入27℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后倒出培養(yǎng)液,每孔加入100 μL DMSO用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)490 nm的吸光值,整個(gè)過(guò)程需避光。以對(duì)照的細(xì)胞相對(duì)活力為100%,將各組吸光值按以下公式換算為細(xì)胞相對(duì)活力。細(xì)胞活力小于100%表示藥劑降低了細(xì)胞活力,反之則表明藥劑對(duì)細(xì)胞活力影響不大。細(xì)胞活力(%)=凋零后受試組OD490/凋零后對(duì)照組OD490×100,細(xì)胞抑制率(%)=(1-細(xì)胞活力)×100。

    1.2.5數(shù)據(jù)分析

    本文中,生物活性測(cè)定結(jié)果的平均數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)”表示,采用DPS 7.05軟件計(jì)算死亡率、毒力回歸方程、LD50及其95%置信區(qū)間。方差分析采用鄧肯氏極差多重比較法(Duncan’s Multiple Ranger Test, DMRT)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 植物提取物的生物活性

    植物材料(2.0 kg)經(jīng)烘干、粉碎后,用甲醇采用冷浸法提取,濃縮得到甲醇粗提物(30.0 g)。甲醇粗提物用2%HCl水溶解,過(guò)濾,過(guò)濾后固體物加蒸餾水洗至pH值為7.0,然后過(guò)濾,60℃烘干,為非生物堿部分;酸水層加氨水調(diào)節(jié)pH值為9.0,CHCl3萃取,萃取液Na2SO4干燥后濃縮,為生物總堿部分。

    測(cè)定了擬黃花烏頭的非生物堿和生物總堿部分對(duì)白背飛虱、褐飛虱的觸殺活性。非生物堿部分和生物堿部分,分別以5 μg/頭(毛細(xì)管0.1164 μL)的劑量測(cè)定了其對(duì)褐飛虱和白背飛虱長(zhǎng)翅型雌蟲48 h的觸殺活性,結(jié)果見表1。結(jié)果表明,擬黃花烏頭中對(duì)褐飛虱和白背飛虱具有觸殺活性的主要成分分布于總生物堿部分。

    進(jìn)一步測(cè)定了擬黃花烏頭生物總堿對(duì)褐飛虱和白背飛虱長(zhǎng)翅型成蟲48 h的觸殺毒力,結(jié)果見表2。

    表1 擬黃花烏頭粗提物(5 μg/頭)對(duì)褐飛虱和白背飛虱長(zhǎng)翅型成蟲48 h的觸殺活性

    表2 擬黃花烏頭生物總堿對(duì)褐飛虱和白背飛虱長(zhǎng)翅型成蟲48 h的觸殺毒力

    擬黃花烏頭生物總堿部分對(duì)兩種稻飛虱均具有一定的觸殺活性,其對(duì)褐飛虱和白背飛虱的48 h觸殺毒力LD50值分別為1.29 μg/頭、0.95 μg/頭(表2)。

    2.2 擬黃花烏頭中生物活性成分的分離

    擬黃花烏頭中生物活性成分的分離以活性追蹤為基礎(chǔ),綜合應(yīng)用硅膠柱層析、ODS、Sephadex LH-20等方法對(duì)擬黃花烏頭生物總堿部分進(jìn)行分離純化,從中分離鑒定了4個(gè)化合物,分別為4-hydroxynicotinic acid methyl ester(1),Ranaconitine(2)、Lappaconitine(3)、13-hydroxylappaconitine (4)。

    化合物1為無(wú)色針狀結(jié)晶,溶于甲醇、丙酮,難溶于氯仿。

    根據(jù)化合物1的EIMSm/z153 [M]+準(zhǔn)分子離子峰,結(jié)合13C NMR和DEPT譜,可判斷其分子式為C7H7NO3。綜合化合物1的1H NMR、13C NMR和DEPT譜示有一個(gè)間位取代的質(zhì)子(δH8.43, d,J=3.0 Hz, H-6)、兩個(gè)鄰位取代的質(zhì)子(δH7.95, dd,J=9.6, 2.4 Hz, H-2)、(δH6.51, d,J=9.0 Hz, H-3),一個(gè)羰基碳(δC167.1, C-7)、一個(gè)與羥基相連的碳(δC165.3, C-4),一個(gè)甲氧基(δH3.60, s, 3H,δC38.5)。結(jié)合HSQC、HMBC歸屬了化合物1的1H、13C關(guān)系,其波譜數(shù)據(jù)歸屬如下:

    1H NMR (600MHz, CD3OD):δ8.43 (1H, d,J=3.0 Hz, H-6), 7.95 (1H, dd,J=9.6, 2.4 Hz, H-2), 6.51 (1H, d,J=9.0 Hz, H-3), 3.60 (3H, s, OMe);

    13C NMR (150MHz, CD3OD):δ167.1 (C-7), 165.3 (C-4), 145.7 (C-6), 141.0 (C-2), 119.3 (C-3), 112.3 (C-5), 38.5 (OMe)。

    上述數(shù)據(jù)根據(jù)1H NMR、13C NMR、HSQC、HMBC進(jìn)行歸屬,經(jīng)鑒定化合物1為4-hydroxynicotinic acid methyl ester。該化合物在文獻(xiàn)上首次出現(xiàn)為化學(xué)合成中間產(chǎn)物(Kitagawa, 1978),其后的文獻(xiàn)報(bào)道也都為合成中間體或終產(chǎn)物(Bernofsky, 1979; Maquestiauetal., 1988)。該化合物為首次從天然產(chǎn)物中分離得到并對(duì)其進(jìn)行波譜數(shù)據(jù)歸屬,其分子式為C7H7NO3,化學(xué)結(jié)構(gòu)圖如圖1中化合物1所示。

    Ranaconitine (2):無(wú)色針狀結(jié)晶;ESI-MS m/z 600[M]+;波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中Ranaconitine相同(Pelletieretal., 1978;Ayhanetal., 1996;Tanetal., 2006);Lappaconitine (3):無(wú)色針狀結(jié)晶;ESI-MS m/z 584[M]+;波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中Lappaconitine相同(Manzooretal., 2008;Nikolayetal., 2008);13-hydroxylappaconitine (4):無(wú)色無(wú)定形粉末;ESI-MS m/z 600[M]+;波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)中13-hydroxylappaconitine相同(Manzooretal., 2008)。

    圖1 擬黃花烏頭甲醇層分離得到的化合物Fig.1 Structures of compounds 1 to 4 isolated from Aconitum anthoroideum

    2.3 化合物對(duì)褐飛虱和白背飛虱的毒殺活性

    用毛細(xì)管微量點(diǎn)滴法,測(cè)定了化合物4-hydroxynicotinic acid methyl ester (1),Ranaconitine (2)、Lappaconitine (3)、13-hydroxylappaconitine (4),對(duì)褐飛虱,白背飛虱長(zhǎng)翅型雌成蟲處理48 h后的觸殺毒力,結(jié)果見表3。

    4個(gè)化合物在處理48 h后對(duì)褐飛虱和白背飛虱長(zhǎng)翅型雌成蟲均具有觸殺活性,其中Ranaconitine的殺蟲活性最強(qiáng),對(duì)褐飛虱和白背飛虱點(diǎn)滴處理后48 h的LD50值分別為0.26 μg/頭、0.25 μg/頭(表3)。

    表3 供試化合物對(duì)褐飛虱和白背飛虱長(zhǎng)翅型雌成蟲48 h的觸殺毒力

    2.4 化合物的細(xì)胞毒性

    在100 μg/mL、50 μg/mL的濃度下測(cè)定了化合物Ranaconitine (2)對(duì)粉紋夜蛾卵巢細(xì)胞(Tn5B1-4) 24 h的細(xì)胞毒性,結(jié)果見表4。

    由表4可以看出,在50 μg/mL、100 μg/mL濃度下,化合物Ranaconitine 對(duì)Tn5B1-4細(xì)胞的細(xì)胞毒性均較弱,校正死亡率均在50%以下。

    表4 供試化合物對(duì)Tn5B1-4細(xì)胞的毒性

    2.5 Ranaconitine對(duì)Tn5B1-4細(xì)胞膜通透性影響

    在測(cè)定Ranaconitine對(duì)Tn5B1-4細(xì)胞的細(xì)胞毒性時(shí),通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)化合物Ranaconitine處理的細(xì)胞的細(xì)胞膜有明顯的孔洞,為進(jìn)一步明確其對(duì)Tn5B1-4細(xì)胞膜的影響,以FITC法檢測(cè)了化合物Ranaconitine在50 mg/mL濃度下對(duì)Tn5B1-4細(xì)胞膜的通透性影響,結(jié)果見表5和圖2。

    從表5可以看出,處理48 h后,Ranaconitine的FITC的熒光強(qiáng)度值為6.32,熒光強(qiáng)度增加率為1.44%,低于印楝素A。從圖2可以看出,Ranaconitine處理后有一定的影響,但作用遠(yuǎn)低于印楝素。

    表5 Ranaconitine對(duì)Tn5B1-4細(xì)胞膜通透性影響(48 h)

    圖2 Ranaconitine對(duì)Tn5B1-4細(xì)胞膜通透性影響(48 h)Fig.2 Effect of the membrane permeability of Ranaconitine to Tn5B1-4

    3 結(jié)論與討論

    在前期試驗(yàn)活性測(cè)定結(jié)果的基礎(chǔ)上,綜合應(yīng)用硅膠柱層析、ODS、Sephadex LH-20等方法對(duì)擬黃花烏頭中對(duì)褐飛虱和白背飛虱具有殺蟲活性的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化,從中分離得到了4個(gè)化合物,4-hydroxynicotinic acid methyl ester(1)、Ranaconitine(2)、 Lappaconitine(3)、 13-hydroxylappaconitine(4),關(guān)于活性有研究報(bào)道Lappaconitine有清除自由基,鎮(zhèn)痛,抗心律失常,抗炎作用(Niuetal., 2018; Sunetal., 2018),從異葉烏頭AconitumheterophyllumWall.中分離得到的13-hydroxylappaconitine對(duì)金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusRosenbach.有抑菌作用,Lappaconitine對(duì)銅綠假單胞桿菌PseudomonasaeruginosaSchr9ter. 和傷寒沙門氏桿菌Salmonellatyphi有抑菌作用(周利娟等,2017),本實(shí)驗(yàn)分離得到的4個(gè)化合物均具有殺蟲活性,其中化合物Ranaconitine (2)對(duì)稻飛虱的觸殺活性最為顯著。從現(xiàn)有研究結(jié)果來(lái)看,從擬黃花烏頭中分離得到的成分以二萜生物堿為主,有研究表明半枝蓮中二萜生物堿Scutegxbatine F,Scutebate F,Scutebarbatine F,Scutebarbatine Y具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性(李丹丹,2018),從紫花高烏頭中分離得到的Lappaconitine(1)、Ranaconitine (2)、septentriodine (3)、6-demethyldelsodine (4)、6-methylumbrofine (5)、8-methyl-10-hydroxylycoctonine (6)和8-methyllycoctonine (7)對(duì)慢性支氣管炎有一定的治療效果(王艷等,2019)。本研究中分離鑒定的Ranaconitine對(duì)稻飛虱有好的觸殺活性,在殺蟲譜上是否具有拓展?jié)摿τ写M(jìn)一步研究。本研究首次對(duì)擬黃花烏頭的化學(xué)成分展開研究,因?yàn)椴杉降闹参锊牧狭可俚脑?,分離和活性測(cè)定研究并不完全,是否還有其他對(duì)稻飛虱有活性的成分或者對(duì)其他生物有活性的化學(xué)成分有待進(jìn)一步研究。

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