三種抗生素對(duì)西花薊馬存活率及腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的影響

葉佳琴，郅軍銳，曾 廣，張 濤，黃 宸，周 丹

(貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025)

昆蟲體內(nèi)棲息著大量微生物，包括細(xì)菌、古菌、原生生物和真菌等，其中99.00%以上屬于細(xì)菌(Egertetal., 2003; 梅承等, 2018)。這些細(xì)菌棲居在腸道內(nèi)并參與宿主的生理反應(yīng)，與宿主相互依賴，互惠共生(Dale, 2006; Shaoetal., 2017)，某些特殊的細(xì)菌在宿主的營養(yǎng)吸收、發(fā)育繁殖、抵御病原菌以及抗藥性等方面起著重要作用(Philipp and Moran, 2013)，因此研究昆蟲腸道細(xì)菌對(duì)于益蟲的保護(hù)以及害蟲的綜合治理具有重要的意義。使用抗生素去除腸道細(xì)菌是一種行之有效且操作容易的方法，并為進(jìn)一步驗(yàn)證腸道細(xì)菌的功能奠定了基礎(chǔ)。Lin等(2015)研究發(fā)現(xiàn)，利福平和硫酸鏈霉素可不同程度的去除小菜蛾P(guān)lutellaxylostella的腸道細(xì)菌，導(dǎo)致小菜蛾較高的死亡率；四環(huán)素、氨芐青霉素和利福平等可有效去除B型和Q型煙粉虱Bemisiatabaci腸道共生菌Hamiltonella(Ruan, 2010; 蘇奇等, 2012)；利福平、鹽酸土霉素和青霉素G鉀鹽可以有效減少大青葉蟬Cicadellaviridis內(nèi)共生菌Sulciamuelleri(練啟仙等, 2019)。使用氯霉素、氨芐青霉素和硫酸鏈霉素等抗生素以不同方式飼喂黑豆蚜Aphiscraccivora后可獲得脫共生菌的蚜蟲(苗雪霞, 2004)。

西花薊馬Frankliniellaoccidentalis(Pergande)屬纓翅目Thysanoptera薊馬科Thripidae花薊馬屬Frankliniella，是一種世界性的入侵害蟲(雷仲仁等, 2004; 吳青君等, 2005)。具有個(gè)體小，易隱匿，繁殖力強(qiáng)和食性廣等特點(diǎn)，可取食60個(gè)科250種作物(Reitzetal., 2019)。西花薊馬可通過直接取食和產(chǎn)卵造成危害，也可間接傳毒危害，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失(Pappuetal., 2009; Yulinetal., 2012; 謝永輝等, 2013)。西花薊馬已對(duì)多種農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，使其防治變得更加困難。

De Vries等(2001a)通過顯微鏡觀察、傳統(tǒng)培養(yǎng)和API-20E腸道菌試劑鑒定等方法確定西花薊馬后腸內(nèi)存在大量的細(xì)菌，屬于歐文氏菌屬Erwinia。西花薊馬若蟲通過取食獲得細(xì)菌且在2齡時(shí)帶菌率為100.00%，在預(yù)蛹和蛹期帶菌率有所下降，但成蟲期又明顯升高(De Vriesetal., 2001b)。腸道細(xì)菌可以使西花薊馬種群產(chǎn)卵率增高、成熟時(shí)間縮短(De Vriesetal., 2004)。去除西花薊馬的腸道細(xì)菌，能否影響西花薊馬種群數(shù)量或降低西花薊馬的存活率？為此本試驗(yàn)利用薄膜飼喂法和葉片浸漬法對(duì)氨芐青霉素、硫酸鏈霉素和氯霉素3種常用抗生素處理西花薊馬，以明確抗生素處理后對(duì)西花薊馬毒害作用以及腸道細(xì)菌的去除效果，并為進(jìn)一步明確腸道菌的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 抗生素

氨芐青霉素、硫酸鏈霉素和氯霉素，購買于生工生物工程(上海)股份有限公司，化學(xué)純研究專用抗生素。

1.2 供試?yán)ハx和植物

供試?yán)ハx：西花薊馬，采自貴州省貴陽市花溪區(qū)周邊蔬菜上，并在實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱(溫度25±1℃，RH 65%～70%，光照周期14 L ∶10 D)內(nèi)用菜豆豆莢長(zhǎng)期飼養(yǎng)。

供試植物：矮生菜豆Phaseolusvulgaris(泰國地豆王品種)種植在人工氣候室中(溫度25±1℃，RH 70%±5%，光照周期14 L ∶10 D)，以營養(yǎng)缽進(jìn)行培育，菜豆長(zhǎng)至兩真葉后備用。菜豆植株生長(zhǎng)期間未受到任何損傷和病蟲危害。

1.3 抗生素的配制

稱取一定粉末狀的氨芐青霉素和硫酸鏈霉素用無菌水進(jìn)行配制，氯霉素用少量的無水乙醇進(jìn)行溶解再用無菌水進(jìn)行配制，3種抗生素均配制成100.00 mg/mL母液備用。使用時(shí)根據(jù)需求將母液分別稀釋成50.00 mg/mL，25.00 mg/mL和12.50 mg/mL濃度，所選濃度根據(jù)查閱文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得，所配制的抗生素溶液置于-20℃保存。

1.4 抗生素不同處理方法

薄膜飼喂法處理，將沖洗干凈的菜豆葉片晾干后用研缽研磨成汁液，用300目紗布過濾獲得葉片汁液，取汁液與抗生素按所需濃度配制成液態(tài)飼料，置于-20℃保存?zhèn)溆?。西花薊馬飼喂參考Murai裝置稍作改進(jìn)(Murai and Ishii, 1982)，使用長(zhǎng)為4 cm雙通的透明玻璃管，一端用300目紗布封口便于透氣，另一端用雙層Parafilm制成取食膜系統(tǒng)。

葉片浸漬法處理，參照Lin等(2015)方法，將采回的大小基本一致菜豆葉片洗凈晾干備用，將晾干的葉片置于3種不同濃度的抗生素溶液中浸泡10 s后取出晾干，然后將晾干的葉片置于底部墊有濕潤濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中。

兩種方法均接入30頭西花薊馬成蟲，每種抗生素的每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)，兩種方法處理下，葉片浸漬法中對(duì)照以無菌水浸泡菜豆葉片，薄膜飼喂法中以在菜豆汁液中加入無菌水作為對(duì)照，每隔24 h更換新鮮液態(tài)飼料和葉片。處理后的西花薊馬放入人工氣候箱中(條件同上)，分別在處理后24 h、48 h和72 h調(diào)查西花薊馬的存活情況。

1.5 西花薊馬腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)

取上述兩方法中氨芐青霉素和硫酸鏈霉素處理72 h和氯霉素處理24 h后存活的西花薊馬15頭，先用75%酒精浸泡處理10 s，再用無菌水清洗3次，去除蟲體殘留酒精，然后在超凈工作臺(tái)中切取西花薊馬腹部置于1.5 mL離心管中，用消毒好的研磨棒磨碎后，加入600 μL無菌水搖勻制成菌液。取100 μL涂LB平板(LB培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，15.0 g/L瓊脂粉)，37℃培養(yǎng)24 h后觀察腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

使用Excel 2013和SPSS 21.0軟件對(duì)抗生素處理后西花薊馬的死亡率進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。死亡率經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后，用Tukey檢驗(yàn)法比較不同處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄膜飼喂法處理下抗生素對(duì)西花薊馬死亡率的影響

薄膜飼喂法處理結(jié)果表明，不同抗生素的濃度對(duì)西花薊馬有一定致死作用(表1)。不論是對(duì)照還是氨芐青霉素所有濃度處理，西花薊馬死亡率均隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而明顯升高，其中50.00 mg/mL氨芐青霉素處理72 h時(shí)西花薊馬死亡率最高，分別是處理24 h和48 h的7.64倍和1.69倍。硫酸鏈霉素在12.50 mg/mL和25.00 mg/mL濃度處理下，西花薊馬的死亡率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而升高，50.00 mg/mL處理下48 h和72 h間沒有明顯的差異。氯霉素的所有濃度處理在48 h和72 h沒有顯著差異且均高于24 h，其中25.00 mg/mL氯霉素處理下48 h和72 h西花薊馬死亡率均是24 h的1.45倍。

在同一時(shí)間下，西花薊馬死亡率隨濃度增加而升高，但不同抗生素處理下升高程度不同。3種抗生素處理24 h時(shí)25.00 mg/mL和50.00 mg/mL濃度死亡率無顯著差異，但均高于12.50 mg/mL和對(duì)照。氨芐青霉素處理后不論在48 h還是72 h，均是50.00 mg/mL西花薊馬死亡率最高為25.67%和43.33%，分別是對(duì)照的3.21和3.61倍。硫酸鏈霉素處理48 h時(shí)，隨濃度增加西花薊馬死亡率不斷升高，在50.00 mg/mL時(shí)達(dá)到40.00%，為對(duì)照的5.00倍，72 h下50.00 mg/mL死亡率最高為44.67%，比對(duì)照提高了32.67%。氯霉素處理后不論是48 h還是72 h西花薊馬的死亡率在3個(gè)濃度下沒有明顯的差異，但均明顯高于對(duì)照，其中48 h時(shí)西花薊馬死亡率在12.50 mg/mL濃度時(shí)為95.33%，是對(duì)照的11.92倍，濃度為25.00 mg/mL和50.00 mg/mL時(shí)西花薊馬死亡率為100.00%為對(duì)照的8.33倍。

2.2 葉片浸漬法處理下抗生素對(duì)西花薊馬死亡率的影響

葉片浸漬法處理結(jié)果表明在同一抗生素不同濃度下，西花薊馬累計(jì)死亡率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而升高(表2)，濃度為50.00 mg/mL氨芐青霉素在48 h 和72 h西花薊馬死亡率沒有顯著差異，對(duì)照和其余濃度下西花薊馬死亡率均為72 h顯著高于24 h和48 h，其中25.00 mg/mL氨芐青霉素處理下西花薊馬死亡率72 h分別為24 h和48 h的6.67倍和2.00倍。硫酸鏈霉素處理24 h后，西花薊馬死亡率在25.00 mg/mL和50.00 mg/mL 2個(gè)濃度下沒有差異，但明顯高于對(duì)照和12.50 mg/mL處理，在48 h時(shí)各濃度之間西花薊馬死亡率無差異，但顯著高于對(duì)照，在72 h時(shí)，死亡率在50.00 mg/mL為36.67%。氯霉素處理后，在24 h和48 h時(shí)西花薊馬的死亡率均隨濃度增加而升高，在72 h時(shí)西花薊馬死亡率在濃度為50.00 mg/mL時(shí)最高為97.67%。

表1 薄膜飼喂法處理下抗生素對(duì)西花薊馬死亡率(%)的影響

在相同時(shí)間下隨著濃度增加西花薊馬死亡率升高，氨芐青霉素處理24 h和72 h時(shí)，西花薊馬死亡率在25.00 mg/mL和50.00 mg/mL 2個(gè)濃度間沒有差異，但顯著高于對(duì)照和12.50 mg/mL處理，其中72 h時(shí)氨芐青霉素25.00 mg/mL和50.00 mg/mL時(shí)西花薊馬死亡率分別為對(duì)照的1.82倍和2.52倍，在48 h時(shí)，氨芐青霉素50.00 mg/mL處理下西花薊馬死亡率最高為20.00%，是對(duì)照的3.53倍。硫酸鏈霉素處理24 h后，西花薊馬死亡率在25.00 mg/mL和50.00 mg/mL 兩個(gè)濃度下沒有差異，明顯高于對(duì)照和12.50 mg/mL處理，48 h時(shí)各濃度之間西花薊馬死亡率無差異，但顯著高于對(duì)照，72 h時(shí)，西花薊馬的死亡率在50.00 mg/mL為36.67%，為對(duì)照的3.33倍。氯霉素處理后，在24 h和48 h時(shí)西花薊馬的死亡率均隨濃度增加，死亡率明顯升高，在72 h時(shí)西花薊馬死亡率在濃度為50.00 mg/mL時(shí)為97.67%為對(duì)照的8.88倍。

薄膜飼喂法和葉片浸漬法飼喂抗生素后，西花薊馬累計(jì)死亡率在2種處理方式下不同。在相同濃度和時(shí)間下均為薄膜飼喂法>葉片浸漬法。其中50.00 mg/mL氨芐青霉素處理后，薄膜飼喂法下西花薊馬死亡率為葉片浸漬法的1.57倍。50.00 mg/mL鏈霉素處理后，薄膜飼喂法下造成西花薊馬死亡率是葉片浸漬法的1.90倍。50.00 mg/mL氯霉素處理后，薄膜飼喂法下造成西花薊馬死亡率比葉片浸漬法提高了41.00%。

2.3 薄膜飼喂法處理下抗生素對(duì)西花薊馬腸道細(xì)菌的去除效果

由于氯霉素的任何濃度在兩種處理方式下導(dǎo)致西花薊馬死亡率較大，48 h和72 h時(shí)使得剩余蟲量較少不足以進(jìn)行腸道內(nèi)細(xì)菌的培養(yǎng)，為驗(yàn)證氯霉素對(duì)西花薊馬腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的去除效果，因此本文選擇氯霉素處理西花薊馬24 h后進(jìn)行腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的去除效果實(shí)驗(yàn)，選擇氨芐青霉素和硫酸鏈霉素2種抗生素處理72 h后對(duì)西花薊馬腸道細(xì)菌的去除實(shí)驗(yàn)。薄膜飼喂法研究結(jié)果顯示，3種抗生素處理對(duì)西花薊馬腸道細(xì)菌有不同程度的抑菌作用(圖1)。取食12.50 mg/mL和25.00 mg/mL濃度的氨芐青霉素西花薊馬腸道可培養(yǎng)細(xì)菌相對(duì)較少，在50.00 mg/mL時(shí)可培養(yǎng)細(xì)菌豐度與對(duì)照基本相同。取食含硫酸鏈霉素液態(tài)飼料的西花薊馬腸道可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量隨濃度的增加而減少，且在50.00 mg/mL時(shí)可培養(yǎng)細(xì)菌幾乎全部被抑制。氯霉素處理西花薊馬24 h后，西花薊馬腸道可培養(yǎng)細(xì)菌在濃度12.50 mg/mL和25.00 mg/mL時(shí)與對(duì)照類似，在濃度50.00 mg/mL時(shí)可培養(yǎng)細(xì)菌與對(duì)照相比受到抑制，但未能完全去除。

表2 葉片浸漬法處理下抗生素對(duì)西花薊馬死亡率(%)的影響

圖1 抗生素薄膜飼喂法對(duì)西花薊馬腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的去除效果Fig.1 Effect of antibiotics on the removal gut culturable bacteria in Frankliniella occidentalis at membrane feeding method

2.4 葉片浸漬法處理抗生素對(duì)西花薊馬腸道細(xì)菌的去除效果

葉片浸漬法研究結(jié)果表明，對(duì)照的可培養(yǎng)細(xì)菌豐度明顯高于氨芐青霉素和硫酸鏈霉素2種抗生素處理組，且不同抗生素抑菌效果存在差異(圖2)。氨芐青霉素處理顯示，在濃度為25.00 mg/mL時(shí)抑菌效果較好，僅觀察到少數(shù)菌落，在50.00 mg/mL和12.50 mg/mL時(shí)均與對(duì)照類似。硫酸鏈霉素處理下，隨著濃度的增加，西花薊馬腸道可培養(yǎng)細(xì)菌豐度降低，僅在LB培養(yǎng)基中觀察到少量菌落。氯霉素處理24 h后，西花薊馬腸道可培養(yǎng)細(xì)菌在任何濃度下均與對(duì)照類似。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，西花薊馬在3種抗生素3個(gè)濃度處理下均隨時(shí)間的延長(zhǎng)累計(jì)死亡率升高，但死亡率的大小與抗生素的處理方式、種類和濃度密切相關(guān)。同一抗生素不同濃度處理對(duì)西花薊馬致死率均在24 h時(shí)不同濃度之間的差異較小，隨時(shí)間延長(zhǎng)，不同濃度造成的死亡率差異變大。前人也有類似的發(fā)現(xiàn)，如Lin等(2015)研究表明隨著利福平和硫酸鏈霉素濃度增加對(duì)小菜蛾毒害作用增大死亡率升高；Vistto等(2009)研究不同抗生素對(duì)大豆夜蛾Anticarsiagemmatalis腸道細(xì)菌的抗敏感性發(fā)現(xiàn)增加四環(huán)素的濃度造成大豆夜蛾更高的致死率。本研究還發(fā)現(xiàn)不同抗生素對(duì)西花薊馬死亡率為氯霉素>硫酸鏈霉素>氨芐青霉素。林曉麗等(2014)的研究也表明，不同抗生素對(duì)小菜蛾的致死作用不同，并且硫酸鏈霉素處理組致死率較低。

圖2 抗生素葉片浸漬法飼喂對(duì)西花薊馬腸道可培養(yǎng)細(xì)菌去除效果的影響Fig.2 Effect of antibiotics on the removal gut culturable bacteria in Frankliniella occidentalis at leaf dipping method

同種抗生素不同的處理方式會(huì)產(chǎn)生不同的致死效果。在本研究中3種抗生素相同時(shí)間和濃度下西花薊馬致死率均是薄膜飼喂法高于葉片浸漬法。可能是因?yàn)楸∧わ曃狗ㄈ∈诚到y(tǒng)是將葉片研磨、過濾取其汁液和抗生素一同配置成較均勻的液態(tài)飼料，因此西花薊馬銼吸能很好的獲得液態(tài)飼料中的抗生素。而葉片浸漬處理，抗生素主要存在葉片表面，滲透到葉肉組織中的含量較少，從而導(dǎo)致以銼吸葉肉細(xì)胞液為主的西花薊馬僅能取食到含量相對(duì)較少的抗生素，進(jìn)而對(duì)西花薊馬致死影響較小。張曉晨等(2018)研究抗生素對(duì)美棘薊馬Echinothripsamericanus(Morgan)的Wolbachia影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)使用薄膜飼喂法造成的死亡率高于涂抹法，而涂抹法類似于葉片浸漬法。

本文探討了抗生素在一定時(shí)間內(nèi)對(duì)西花薊馬腸道可培養(yǎng)細(xì)菌的去除效果，結(jié)果表明飼喂硫酸鏈霉素后，西花薊馬腸道可培養(yǎng)細(xì)菌隨濃度增加去除效果越明顯。蘇奇等(2012)使用利福平、氨芐青霉素和硫酸卡那霉素3種抗生素去除煙粉虱共生菌Hamiltonella時(shí)也發(fā)現(xiàn)濃度越高，去除效果越好。使用氨芐青霉素處理后隨濃度增加可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量減少，在濃度為25.00 mg/mL時(shí)去除效果較好，但繼續(xù)升高濃度可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量反而增多。前人在小菜蛾研究中也存在類似情況，在青霉素處理72 h后細(xì)菌數(shù)量不再下降，甚至略有回升(林曉麗, 2014)。原因可能是這些昆蟲適應(yīng)力非常強(qiáng)，隨著抗生素的攝入，產(chǎn)生了某種適應(yīng)力，也可能某些細(xì)菌已經(jīng)對(duì)抗生素產(chǎn)生了抗性(Yulinetal., 2012; Ignasiak and Maxwell, 2017; Banseptetal., 2019)。以薄膜飼喂法飼喂氯霉素24 h后在濃度為12.50 mg/mL和25.00 mg/mL未見去除效果，將濃度增加到50.00 mg/mL時(shí)去除效果較好，張曉晨等(2018)研究利福平對(duì)美棘薊馬共生菌Wolbachia的去除作用時(shí)表明，濃度越高去除效果越好。

本研究表明，3種抗生素可明顯造成西花薊馬死亡率升高和有效去除西花薊馬腸道可培養(yǎng)細(xì)菌，但去除西花薊馬腸道細(xì)菌后對(duì)其個(gè)體發(fā)育和種群數(shù)量的影響還需要進(jìn)一步的研究，這也為后期研究西花薊馬腸道細(xì)菌的功能奠定了基礎(chǔ)。