歐洲黑蜂和新疆黑蜂越冬期抗氧化酶活性及相關基因表達分析

劉楠楠，張 發(fā)，徐 凱，王永勝，牛慶生

(吉林省養(yǎng)蜂科學研究所，吉林132108)

歐洲黑蜂Apismelliferamellifera(European Dark Bee)是西方蜜蜂ApismelliferaLinnaeus的一個亞種，原產于阿爾卑斯山以西和以北的歐洲地區(qū)，早期隨著歐洲移民和商業(yè)往來分布至全世界，現有的英國蜂、德國蜂、法國棕蜂、俄羅斯中蜂等都屬于歐洲黑蜂的地方品種(席芳貴，1995)。2007年，我國第一次通過官方渠道正式引進歐洲黑蜂，批準吉林省養(yǎng)蜂科學研究所從俄羅斯基洛夫市引進種蜂王，現已利用基因庫活體保存純種歐洲黑蜂70群(劉玉玲等，2018)。

新疆黑蜂(Xinjiang Black Bee)是我國境內西方蜜蜂的一個地方品種，在20世紀初由俄國傳入中國新疆伊犁和阿勒泰地區(qū)，經過長期混養(yǎng)、自然雜交和人工選育后，逐漸形成的一個適應新疆當地蜜源和氣候條件的蜂蜜高產型蜂種(薛運波，2017)，2006年被農業(yè)部列入《國家級畜禽遺傳資源保護名錄》。目前新疆黑蜂飼養(yǎng)數量急劇減少，種性退化嚴重，物種處于瀕危狀態(tài)(張海峰，2018)。

歐洲黑蜂和新疆黑蜂均屬于西方蜜蜂的黑色蜂種，雖然性情兇暴，極易蜇人，不易馴養(yǎng)(葛鳳晨，2017；劉玉玲等，2018)，但它們同樣擁有優(yōu)于其他西方蜜蜂品種的優(yōu)良性狀，具有抗逆性和抗病力強、耐寒性好、生產性能和越冬性能優(yōu)異、善于利用零星蜜源和大宗蜜源等生物學特性，尤其是在惡劣的氣候和蜜源條件下展現出的強韌生命力。例如，歐洲黑蜂與其它品種雜交，其子代常表現出不尋常的生活力和產蜜能力，在蜜源較貧乏地區(qū)，其他蜂種常耗盡所有貯蜜，唯有勤儉的黑蜂，尚余些存蜜(席芳貴，1995)；新疆黑蜂在越冬期漫長，冬季極端溫度達-40℃的自然條件下，仍可在室外安全越冬；在室內越冬同其他蜂種相比更耐寒和省飼料，在早春室外氣溫8℃左右，即可出巢采集(哈力木拜克，2009)。因此，它們是蜜蜂品種家族中重要的種質遺傳資源，極有生產利用價值和育種開發(fā)應用潛力。

蜜蜂個體的抗氧化能力與蜂群的壽命、抗病力和抗逆性有著直接聯系(肖培新，2010)，抗氧化酶的功能是清除機體內過剩的活性氧，保護機體免受環(huán)境脅迫的危害(Bolter and Chefurka，1990)，抗氧化酶基因的表達可在一定程度上體現蜜蜂的生存狀況、健康程度和壽命(劉春蕾等，2017)。昆蟲在低溫不良環(huán)境下，體內抗氧化酶活力明顯升高，多種酶協(xié)同作用調節(jié)活性氧變化(唐維媛等，2016)，對耐寒的金針癭蚊越冬幼蟲的冷激處理研究表明，體內的氧化酶活性上升，對昆蟲并未造成氧化損傷(Marcelo and Tania，2002)；對越冬期意大利蜜蜂的研究表明，不同越冬飼料有助于提高越冬蜜蜂中腸的抗氧化能力，利于蜂群經受冬季低溫的制約(劉春蕾等，2017)。谷氧還蛋白(Grx)、甲硫氨酸亞砜還原酶A(MsrA)和卵黃原蛋白(Vg)是昆蟲體內抗氧化酶家族的重要成員，在蜂群抵抗不良環(huán)境因素過程中發(fā)揮維持氧化還原平衡、參與受損蛋白修復和保護機體免受氧化損傷的作用(趙紅霞等，2010；鞏志宏，2011；姚朋波，2014)。蜜蜂中含有已確定的Grx1和Grx2兩個基因，預測分析它們分別定位在細胞質和線粒體中(鞏志宏，2011)，參與維持細胞內氧化還原穩(wěn)態(tài)、生長抑制和細胞凋亡等過程(Damdimopoulosetal.，2002；黃金昌和郭榮富，2010)。MsrA基因是生物體內的抗氧化及蛋白修復因子(Levineetal.，1999)，具有間接的抗氧化作用，在對中華蜜蜂MsrA基因的克隆及其表達分析的研究中推測，它在抵抗高溫和紫外線的外界脅迫過程中發(fā)揮了重要作用(鞏志宏，2011)。Vg基因在蜜蜂的胚胎營養(yǎng)(Rutz and Lüscher，1974)、行為調控(Engels and Fahrenhorst，1974)、延長壽命(Amdametal.，2005；Seehuusetal.，2006)和氣候適應(Flurietal.，1977)等方面發(fā)揮重要作用，現有研究已明確Vg基因可幫助歐洲蜜蜂適應低溫環(huán)境(Amdametal.，2005)，從而提高蜂群的抗寒能力。越冬期是養(yǎng)蜂生產管理的重要階段，當年的蜂群越冬效果直接決定了翌年的基礎蜂群數量，而蜂群的耐寒性則是安全越冬的關鍵因素之一。目前，關于歐洲黑蜂和新疆黑蜂在冬季自然寒冷環(huán)境下體內抗氧化酶活性及相關基因表達分析的研究還未見報道。

本試驗選取越冬時期的歐洲黑蜂和新疆黑蜂進行越冬性能指標的測定和抗氧化酶活性變化及相關功能基因表達的分析，以評價兩個蜂種的越冬性能，明確二者在越冬期的抗氧化酶變化規(guī)律和相關功能基因的表達情況，探討蜜蜂機體在受低溫環(huán)境脅迫時體內存在的抗氧化防御作用機制和變化規(guī)律，更好地了解它們對越冬的適應能力，進而為抗寒蜂種的選育研究奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗蜂群

試驗所用蜜蜂為純種歐洲黑蜂和新疆黑蜂，由吉林省養(yǎng)蜂科學研究所蜜蜂遺傳資源基因保護中心提供。

1.2 試驗時間和地點

2017年10月至2018年3月，吉林省養(yǎng)蜂科學研究所蜜蜂遺傳資源基因保護中心南山蜂場。

1.3 主要試劑和儀器

總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒、總超氧化物氣化酶(T-SOD)試劑盒和過氧化氫酶(CAT)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；PrimeScriptTMRT Master Mix反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；總RNA提取試劑Trizol，購自美國Invitrogen公司。

Ultrospec 7000紫外可見分光光度計，英國柏楉有限公司；Thermo Scientific Sorvall Stratos低溫高速離心機；7500 FAST型實時熒光定量儀(ABI)；9902型觸摸式PCR儀(ABI)；Invitrogen Qubit 3.0 Fluorometer熒光定量儀(美國Life公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1樣品采集

在蜂群越冬前標記2個品種新出房的工蜂，整個越冬期內每月相同日期(當月的21日)進行一次樣品采集，置于-80℃超低溫冰箱內保存，備用。

1.4.2越冬蜂群管理

選取歐洲黑蜂(群號分別為E5-1、E5-37、E5-54和E5-147)和新疆黑蜂(群號分別為X5-12、X5-107、X5-116和X5-143)試驗蜂群各4群，在越冬前補喂越冬飼料，各品種蜂群以每群5框蜂為標準進行平衡，蜂數多的調出，蜂數少的從本品種內的蜂群中補充，保持群勢相當。入室越冬時將兩個品種蜂群同時稱量蜂群重量，擺放在同一越冬室內越冬。試驗蜂群于2018年11月21日入室越冬，次年3月21日出越冬窖。

1.4.3越冬性能指標測定

1.4.3.1 蜂群損失率

記錄越冬開始蜂數(框)、越冬結束蜂數(框)，計算越冬期蜂群損失率。

1.4.3.2 飼料消耗率

記錄越冬入室蜂群重量(kg)、越冬出室蜂群重量(kg)，計算越冬期蜂群飼料消耗率。

1.4.4抗氧化酶活性測定

以當年的10月和11月為蜜蜂越冬前期，12月和次年1月為蜜蜂越冬中期，次年2月和3月為蜜蜂越冬后期，測定蜜蜂樣本的抗氧化酶活力值。嚴格按照試劑盒說明操作，制備組織勻漿液，計算得出越冬時期每月樣品的T-AOC(總抗氧化能力)、T-SOD酶(總超氧化物歧化酶)和CAT酶(過氧化氫酶)酶活力值。測定時每組樣品做3個平行處理，所有待測樣本為同一批次。

1.4.5抗氧化能力相關基因表達量測定

1.4.5.1 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

將蜜蜂樣品經液氮研磨后，按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，在熒光定量儀上測定OD260/OD280，檢測提取的RNA樣品濃度和純度，再根據PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒說明書反轉錄合成cDNA模板，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5.2 引物設計

以β-肌動蛋白(β-actin)為內參基因,目的基因引物設計參考序列來自于NCBI數據庫，委托上海生工生物科技有限公司完成，基因引物序列如表1所示。

表1 試驗所使用的引物

1.4.5.3 實時熒光定量PCR檢測

根據TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR，測定蜜蜂越冬期工蜂抗氧化功能相關基因SOD、CAT、Grx1、MsrA和Vg基因的mRNA相對表達量。反應體系總體積為20 μL，包含cDNA模板2 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL。反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火及延伸34 s，45個循環(huán)。每組樣本重復測定3次。

1.5 數據處理與分析

將獲得的實驗數據應用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計處理，采用數據分析中的one-way ANOVA進行單因素方差分析(P< 0.05表示差異顯著)，隨后采用Tukey’s HSD進行多重檢驗；熒光定量PCR中，根據標準曲線以及熒光曲線的Ct值，采用2-ΔΔCt法進行數據分析；應用GraphPad Prism 8.0軟件進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 越冬蜂群勢測試

在歐洲黑蜂和新疆黑蜂的越冬期間，歐洲黑蜂和新疆黑蜂的蜂群損失率分別為32.86%和32.91%，飼料消耗率分別為23.41%和23.91%(表2)。由此可見，兩個蜂種在越冬性能表現方面大體相當。

2.2 越冬期體內抗氧化酶活性變化

2.2.1總抗氧化酶(T-AOC)活性

歐洲黑蜂和新疆黑蜂越冬各階段T-AOC酶活力進入越冬期后呈逐步升高趨勢，僅在越冬中期(1月份)有所下降，之后逐步升高，在越冬后期達到最高值，且差異顯著(P<0.05)(圖1)。

表2 歐洲黑蜂和新疆黑蜂越冬蜂群勢測試統(tǒng)計表

圖1 越冬期歐洲黑蜂和新疆黑蜂的T-AOC酶活性變化Fig.1 Changes of T-AOC activity of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

2.2.2總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性

歐洲黑蜂和新疆黑蜂進入越冬期后，兩者的T-SOD酶活性均呈下降趨勢，在越冬中期(1月份)達最低值，在越冬后期有所升高，且差異顯著(P<0.05)(圖2)。

圖2 越冬期歐洲黑蜂和新疆黑蜂的T-SOD酶活性變化Fig.2 Changes of T-SOD activity of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

2.2.3CAT酶活性

歐洲黑蜂和新疆黑蜂越冬各階段的CAT酶活力呈現先升高再降低又再升高的趨勢，在越冬中期(1月份)達最低值，且差異顯著(P<0.05)(圖3)。

圖3 越冬期歐洲黑蜂和新疆黑蜂的CAT酶活性變化Fig.3 Changes of CAT activity of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

2.3 越冬期體內抗氧化能力相關基因的表達量變化分析

2.3.1SOD基因mRNA表達量

歐洲黑蜂和新疆黑蜂在越冬各階段的SOD基因mRNA相對表達量均在越冬中期(12月和1月)達到最低值，與SOD酶活性的變化規(guī)律大致相同(圖4)。

圖4 越冬期歐洲黑蜂和新疆黑蜂SOD基因的表達變化Fig.4 Changes of gene SOD expression of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period注：圖中不同字母表示在該基因在不同越冬時期的表達量存在顯著差異(P<0.05)。下圖同。Note: Data with different letters indicated significant difference between different overwintering period at 0.05 level.The same below.

2.3.2CAT基因mRNA表達量

歐洲黑蜂的CAT基因mRNA相對表達量呈先降低再升高的趨勢，新疆黑蜂的CAT基因表達量亦呈先降低再升高的趨勢(越冬前期基因表達量差異不顯著)，且二者均在越冬中期(12月和1月)達到最低值，與CAT酶活性的變化規(guī)律一致(圖5)。

圖5 越冬期歐洲黑蜂和新疆黑蜂CAT基因的表達變化Fig.5 Changes of gene CAT expression of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

2.3.3Grx1基因mRNA表達量

歐洲黑蜂和新疆黑蜂在越冬各階段的Grx1基因mRNA相對表達量均在越冬后期(2月和3月)急劇升高，達到峰值，且差異顯著(P<0.05)(圖6)。

圖6 越冬期歐洲黑蜂和新疆黑蜂Grx1基因的表達變化Fig.6 Changes of gene Grx1 expression of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

2.3.4MsrA基因mRNA表達量

歐洲黑蜂的MsrA基因mRNA相對表達量呈現先降低再升高的趨勢，在越冬中期(12月)達最低值；新疆黑蜂的MsrA基因表達量呈現相同的表達規(guī)律，也在越冬中期(1月)達到最低值(圖7)。

圖7 越冬期歐洲黑蜂和新疆黑蜂MsrA基因的表達變化Fig.7 Changes of gene MsrA expression of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

2.3.5Vg基因mRNA表達量

歐洲黑蜂和新疆黑蜂在越冬各階段的Vg基因mRNA相對表達量在越冬中前期(10月、11月和12月)均呈逐漸升高趨勢；在越冬的中后期(1月、2月和3月)，歐洲黑蜂的Vg基因表達量呈遞增趨勢，新疆黑蜂則呈遞減趨勢，表明較越冬前期和后期，越冬中期可能是Vg基因表達的一個時間節(jié)點(圖8)。

圖8 越冬期歐洲黑蜂和新疆黑蜂Vg基因的表達變化Fig.8 Changes of gene Vg expression of European Dark Bee and Xinjiang Black Bee during overwintering period

3 結論與討論

蜜蜂是農業(yè)作物中普遍存在的傳粉媒介，養(yǎng)蜂業(yè)亦是農業(yè)增產的重要途徑(劉朋飛等，2011)。蜂群的安全越冬對翌年的養(yǎng)蜂生產至關重要，在冬季，蜂群以眾多工蜂和蜂王的組合通過聚集成團的方式來抵御嚴寒，低溫冷害是蜜蜂生存所面臨的重要非生物逆境脅迫，歐洲蜜蜂和新疆黑蜂不僅具有較強耐寒性，還具有優(yōu)異的生產性能，了解它們的越冬期生理及生存策略對于保護和保存這種寶貴的種質資源至關重要。

昆蟲體內的抗氧化防御系統(tǒng)作為機體抵御外界逆境條件脅迫的一道防線，在生物體中占有舉足輕重的地位，一旦其抗氧化防御機制被打破，自由基的產生就會增多，從而引起氧化應激損傷(吳啟仙和夏嬙，2014)。總抗氧化能力(T-AOC)是反映生物體內抗氧化能力的重要指標，超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)則屬于昆蟲體內存在的保護酶系統(tǒng)(Fridovich，1977)，相互協(xié)作調控增強機體的抗逆性(劉楠楠等，2018)。Grx基因、MsrA基因和Vg基因亦是昆蟲在不利條件下發(fā)揮重要調控作用的抗氧化功能基因(Ruanetal.，2002；Anetal.，2013；張衛(wèi)星和胥保華，2014)。

本研究結果表明，歐洲黑蜂和新疆黑蜂在蜂群損失率和飼料消耗率的越冬性能表現方面無明顯差異，分別為32.86%、23.41%和32.91%、23.91%；薛運波等(2003)等連續(xù)兩年對喀爾巴阡蜂、卡尼鄂拉蜂、高加索蜂、美意蜂、澳意蜂和原意蜂的越冬蜂群進行越冬測試，結果顯示黑色蜂種對比黃色蜂種的越冬群勢削弱率和越冬飼料消耗相對較少，認為黑色蜂種的耐寒性能較強，也進一步驗證了本研究的結論，即黑色蜂種更具有越冬優(yōu)勢。

在抗氧化酶活性表現方面，T-AOC酶活力總體呈逐步升高趨勢，僅在越冬中期(1月份)有所下降，越冬后期達峰值；T-SOD酶活性在越冬中期(1月份)達最低值，后期又呈升高趨勢；CAT酶活力呈現先升高再降低再升高的趨勢，在越冬中期(1月份)達最低值。在抗氧化酶基因表達方面，兩個蜂種的SOD基因和CAT基因的表達模式與酶活性的變化基本一致，均在越冬中期(12月和1月)達到最低值；Grx1基因的表達量在越冬后期急劇升高，達到峰值；歐洲黑蜂和新疆黑蜂的MsrA基因的表達量分別在越冬中期(12月和1月)達最低值；越冬中期可能是兩個蜂種Vg基因的表達的時間節(jié)點，在越冬中前期均呈逐漸升高趨勢，到了越冬中后期，歐洲黑蜂的Vg基因表達量呈遞增趨勢，新疆黑蜂則呈遞減趨勢。綜合以上實驗結果可知，一方面，越冬蜜蜂在經受冬季低溫制約的不利環(huán)境下，體內的保護酶系統(tǒng)受到了激活，對機體的氧化應激做出了一定的適應性改變，形成了響應低溫逆境的應答機制。胡雙慶等(2019)在菲和鉻復合脅迫對蜓蚓抗氧化酶活性及其功能基因表達的影響研究中發(fā)現，蜓蚓抗氧化酶活性與其功能基因表達之間總體表現出正相關性，認為功能基因表達可以作為一種重要的生物標志物。夏振宇等(2019)對低溫脅迫下越冬期中華蜜蜂體內抗氧化指標及耐寒基因表達影響進行研究發(fā)現，耐寒基因TPS和SOD表達上調，CAT表達下調，提示中華蜜蜂對低溫脅迫存在耐寒響應的生理機制，認為中華蜜蜂體內抗氧化酶系統(tǒng)存在一定的平衡機制，在機體面對外界不良環(huán)境時協(xié)同發(fā)揮作用，與本研究的結論一致。另一方面，越冬中期是酶活性變化和基因表達的顯著變化時期，在養(yǎng)蜂生產上應特別注意對越冬中期蜂群的管理和保護。在整個越冬歷期中，越冬中期較前期和后期的氣溫最低，是蜜蜂群體經歷低溫冷傷害最為嚴重的階段，這是導致越冬中期多數抗氧化酶活性及其基因表達達到最低值的原因。

此外，同為耐寒性突出表現的優(yōu)異蜂種，歐洲黑蜂和新疆黑蜂在越冬期間的抗氧化酶活性變化規(guī)律和抗氧化功能基因表達模式上表現出總體的一致性。新疆黑蜂在品種形成的過程中有歐洲蜜蜂血統(tǒng)的滲入，在歷史上對低溫極端環(huán)境有良好的適應性，具有相同mRNA量表達規(guī)律的抗氧化酶基因，可以為揭示蜜蜂體內抵御低溫的耐寒機理研究提供新線索，有助于理解它們在東北當地氣候、蜜源等生態(tài)條件下的產生的環(huán)境適應性，進而為揭示蜜蜂耐寒分子機制和抗寒蜂種的選育提供基礎的研究數據。

許多生態(tài)學和生理學研究已經確定脂質儲存和代謝是昆蟲在越冬期和低溫環(huán)境下生存的必要條件(Tothetal.，2009；Wasielewskietal.，2014；Dustyetal.，2016)。在寒冷的冬季，蜜蜂需要更多的能量來維持巢內溫度和自身的基礎代謝。大量增加的脂質儲存被認為是越冬的必要適應，特別是在膜翅目昆蟲的成蟲中(Tothetal.，2009)。因此，未來的研究工作將更多關注歐洲黑蜂和新疆黑蜂在越冬過程中脂質代謝相關通路中基因的表達變化，以期在全基因組水平上對蜂群越冬基因調控的時間性和特異性提供更多見解。