鴨蛋卵清蛋白多肽的酶解條件優(yōu)化及生物活性

王 倩，賀 萍，劉 琪，曾凡珂，張曉元，賴富饒，吳 暉*，

（1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州510640；2.韶關(guān)市華工高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)研究院，廣東 韶關(guān)512027）

鴨蛋卵清蛋白約占鴨蛋總蛋白質(zhì)的54%，是蛋清中最主要的蛋白質(zhì)，且含有豐富的Ile、Leu、Met、Val和Phe。卵清蛋白營養(yǎng)價值較高，具有良好的蛋白質(zhì)膠凝、乳化和起泡等功能特性，可在食品加工中賦予食品特殊的口感和風(fēng)味[1]。關(guān)于卵清蛋白的研究主要集中在功能及物理特性的改性[2-3]、卵清蛋白與多糖、亞油酸制備納米顆粒復(fù)合物[4-6]和制備生物活性肽[7-8]等方向。

生物活性肽的制備一般有酶解法、微生物發(fā)酵法和人工合成法。酶解法因操作簡便、可工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)點而被大量采用。宋宏新[9]用DPPH自由基清除率和水解度為指標(biāo)，用堿性蛋白酶水解雞蛋卵白蛋白制備抗氧化活性肽，其產(chǎn)物的DPPH自由基清除率達(dá)到了96.92%，唐文婷[10]利用pepsin和trypsin復(fù)合水解卵白蛋白，再通過純化分離得到2個具有抗菌活性的多肽組分，劉麗莉[11]探究了雞蛋卵清蛋白的酶解工藝和產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用堿性蛋白酶水解，樣品水解度可達(dá)到26.55%，Chamila[12]考察了幾種蛋白酶從蛋清中釋放抗氧化肽的能力，選擇了蛋白酶P1從卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和半胱氨酸抑素中分離得到16條抗氧化肽。酶解法以簡單易控制的優(yōu)點已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于蛋白酶解產(chǎn)物的制備中。

文獻(xiàn)中報道的動植物蛋白經(jīng)酶解制備的多肽活性主要包括抗氧化、抗菌[13]、鈣螯合[14]、抗癌[15]、抗高血壓[16]、降血壓[17]和免疫調(diào)節(jié)[18]等。 任堯[19]報道了雙酶水解鴨蛋蛋清多肽制備抗氧化肽的方法，陳功[20]報道了堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶水解咸鴨蛋脫鹽蛋清制備抗氧化肽的工藝，Cho等[21]比較了Alcalase、Neutrase、Flavourzyme、Protamex和Ficin 5種蛋白酶對雞蛋蛋清蛋白的水解作用，發(fā)現(xiàn)中性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度和α-氨基酸產(chǎn)量最高；陳棟梁等[22]的研究表明雞蛋卵清蛋白的復(fù)合蛋白酶水解產(chǎn)物對BALB/c小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫均有顯著增強(qiáng)作用。以上研究表明以鴨蛋卵清蛋白為原料，采用酶解法獲得一種具有多種生物活性的多肽產(chǎn)物具有可行性，同時也為鴨蛋的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鴨蛋卵清蛋白，實驗室制備（pH 4.5下60%飽和度硫酸銨沉淀所得，蛋白質(zhì)總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.7%）；RAW 264.7細(xì)胞，購自廣東省中醫(yī)院；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶，購自上海源葉生物試劑公司；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2’-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉）二胺鹽（ABTS）、2，2’-偶 氮 （二 異 丁 基 脒） 二 鹽 酸 鹽（AAPH），購自Sigma公司；其余試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Infinite M1000 Pro酶標(biāo)儀，購自瑞士Tecan公司；高速冷凍離心機(jī)，購自安徽嘉文儀器裝備有限公司；HERAcell 150 iCO2培養(yǎng)箱，購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白酶酶活的測定蛋白酶酶活測定的方法參考李艷紅[23]略做修改。稱取100 mg（或100μL）酶 分 別 置 于1、2號 管 中，3號 管 加 入100μL的0.02 mol/L pH 8.00磷酸鈉緩沖液進(jìn)行溶解定容，稀釋1 000倍。取稀釋后的樣品酶液1 mL分別置于試管中37℃預(yù)熱3 min，加入2 mL 1 g/dL酪蛋白溶液，在37℃水浴15 min。在1、2、3號管中立即加入3 mL 10 g/dL三氯乙酸，4 500 r/min離心10 min。取上清液0.5 mL，加0.55 mol/L碳酸鈉2.5 mL，福林酚試劑0.5 mL，37℃水浴中避光孵育15 min，最后在680 nm下測定吸光值。以L-酪氨酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，3號管為空白對照。

酶活力單位定義：在37℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg L-酪氨酸為一個酶活單位，U/（g·min）。

式中，A為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算的L-酪氨酸質(zhì)量濃度（μg/mL）；F為稀釋倍數(shù)；V為混合液體積（mL）；t為反應(yīng)時間（min）；W為酶質(zhì)量（g）。

1.2.2 水解度的測定取250μL酶解上清液，加入2.0 mL 0.212 5 mol/L pH 8.20磷酸鹽緩沖液和1.0 mL體積分?jǐn)?shù)0.01% TNBS，50℃下避光孵育30 min，加入2 mL 0.01 mol/L的Na2SO3終止反應(yīng)，冷卻至室溫后在420 nm下測量吸光值。以L-亮氨酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出α-氨基酸含量。

式（2）中，DH為水解度（%）；Lt為時間t時釋放的α-氨基酸（mmol/L）；L0為鴨蛋卵清蛋白原始的α-氨基酸（mmol/L）；Lmax為鴨蛋卵清蛋白在用6 mol/L HCl在100℃下水解24 h后的總氨基酸量（mmol/L）。

1.2.3 水解酶的篩選鴨蛋卵清蛋白用蒸餾水溶解，配制成1 g/dL的蛋白質(zhì)溶液，分別取100 mL溶液至5個250 mL錐形瓶中，按照表1的條件進(jìn)行酶解，加酶量均為2×104U/（g·min），酶解時間3 h，分別測量酶解上清液的水解度，確定最佳的鴨蛋卵清蛋白水解酶，并采用正交實驗確定最佳酶解條件。

表1 酶的特性Table 1 Enzyme characteristics

1.2.4 單因素實驗設(shè)計

1）最佳酶解時間的篩選 根據(jù)1.2.3的結(jié)果選擇木瓜蛋白酶進(jìn)行后續(xù)酶解實驗。選擇酶解時間分別為1、2、3、4、5、6 h進(jìn)行單因素實驗。根據(jù)1.2.3的結(jié)果選擇木瓜蛋白酶，酶解pH 7.50，加酶量為2×104U/（g·min），在50℃下酶解，通過測定樣品的水解度選擇最適宜的酶解時間。

2）加酶量的篩選 選用加酶量分別為1×104、2×104、3×104、4×104、5×104、6×104U/（g·min），酶解pH 7.50，在50℃下加入木瓜蛋白酶酶解3 h，通過樣品的水解度選擇最適宜的加酶量。

3）酶解溫度的篩選 選擇酶解溫度分別為40、45、50、55、60℃，酶解pH 7.50，加入木瓜蛋白酶酶解3 h，加酶量為2×104U/（g·min），通過測定樣品的水解度選擇最適宜的酶解溫度。

4）酶解pH的篩選 選擇酶解pH分別為5.00、5.50、6.00、6.50、7.00、7.50、8.00，加入木瓜蛋白酶酶解3 h，加酶量為2×104U/（g·min），在50℃下酶解，通過測定樣品的水解度選擇最適宜的酶解pH。

1.2.5 正交試驗設(shè)計在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以水解度為考察對象，每個因素選取3個水平，建立正交試驗因素水平表，通過L9（34）正交試驗對鴨蛋卵清蛋白水解條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，正交實驗設(shè)計見表2。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels for orthogonal test

1.2.6 HD相對分子質(zhì)量的測定采用HPLC進(jìn)行相對分子質(zhì)量的測定。配制1 mg/mL的HD溶液，過0.22μm的濾膜后進(jìn)色譜柱TSK gel 2000SWXL（300 mm×7.8 mm）。流動相：乙腈/水/三氟乙酸（20∶80∶0.1，體積比），檢測波長220 nm，流量0.5 mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10μL。用細(xì)胞色素C（相對分子質(zhì)量12 500）、抑肽酶（相對分子質(zhì)量6 500）、桿菌肽（相對分子質(zhì)量1 450）、乙?；碾腉GYR（相對分子質(zhì)量451.2）和還原型谷胱甘肽（相對分子質(zhì)量307.3）作為相對分子質(zhì)量校正標(biāo)準(zhǔn)[25]。

1.2.7 HD的免疫活性評價細(xì)胞免疫活性測定參考張婷等[26]的方法。接種100μL細(xì)胞濃度1×106個/mL的RAW 264.7細(xì)胞懸液于96孔板中，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，吸去上清液，加入100μL不同質(zhì)量濃度（1 000、500、250、125、62.5μg/mL）的HD溶液，陽性對照組為20μg/mL的LPS，空白組為DMEM培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清液，用試劑盒檢測上清液中NO、TNF-α和IL-6的表達(dá)量。

1.2.8 HD對AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血的保護(hù)作用參考Ma等[27]的方法略做修改。取新鮮抗凝羊血10 mL，1 200 g離心5 min，取沉淀。再用pH 7.4的PBS清洗5次后配制成體積分?jǐn)?shù)20%的紅細(xì)胞懸浮液。用PBS將樣品配制成不同質(zhì)量濃度（1 000、750μg/mL和500μg/mL），在試管中加200μL樣品和200μL紅細(xì)胞懸液，37℃孵育30 min后，加入400μL AAPH（200 mmol/L）孵育1.5 h，加入5 mL PBS稀釋樣品后1 200 g離心10 min，取上清液在540 nm下測定吸光值A(chǔ)。全溶血組用蒸餾水替代PBS，其吸光值記為B。

1.2.9 HD的體外抗氧化活性評價

1）DPPH自由基清除能力 參考You[28]的方法。取2 mL不同質(zhì)量濃度的HD溶液，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液混勻，避光反應(yīng)30 min后于517 nm測定吸光度，用Trolox作陽性對照。

2）ABTS+·自由基清除能力 參考Zhang[29]的方法略做修改。取400μL不同質(zhì)量濃度的HD溶液，加4 mL ABTS+·反應(yīng)液，避光反應(yīng)20 min后，于734 nm下測吸光值。以Trolox作為陽性對照。

3）ORAC法測定樣品體外抗氧化能力 參考王光[30]的方法略做修改，在96孔板中加入25μL樣品（質(zhì)量濃度分別為1 000、500、250、125、62.5μg/mL）、25μL的403.2 nmol/L熒光素鈉，37℃下預(yù)熱5 min，用排槍加150μL 17.07 mmol/L的AAPH啟動反應(yīng)，在485/338 nm下進(jìn)行連續(xù)測定2 h，設(shè)定每5分鐘測量一次熒光值。以Trolox作陽性對照，同時設(shè)定只加熒光素鈉的熒光自然衰減組對照、加蒸餾水的空白對照組。

公式（6）中，AUC樣品為樣品的積分面積；AUC+AAPH為加PBS組的積分面積；n為Trolox的摩爾濃度（μmol/L）；c為樣品質(zhì)量濃度（μg/mL）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均做3組平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差（mean±SD）表示。采用Origin 8.5、SPSS 17.0和正交設(shè)計助手V3.6進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白酶的酶活測定

根據(jù)L-酪氨酸測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.008 9x+0.030 5，R2=0.999 1。5種蛋白酶的酶活測定結(jié)果見表3，5種蛋白酶的酶活大小存在顯著性差異（P＜0.05），風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的酶活最高，中性蛋白酶的酶活最低。實驗中測定的5種蛋白酶的實測酶活略高于李艷紅[23]的實驗結(jié)果，推測原因是蛋白酶的酶活與其存放條件和存放時間有關(guān)，存放越久酶活越低，蛋白酶的實測酶活就可能低于其標(biāo)注酶活，因此為了試驗的準(zhǔn)確性，對本實驗中用到的5種酶進(jìn)行酶活標(biāo)定，以便試驗結(jié)果的統(tǒng)一。

表3 5種蛋白酶的實測酶活Table 3 Enzyme activities of 5 proteases

2.2 5種水解酶的篩選

蛋白酶的種類是影響酶解效率的重要因素之一，因底物與酶的特異性結(jié)合位點的不同而顯示出差距。Doucet報道[31]堿性蛋白酶可水解蛋白質(zhì)中的Glu、Met、Leu、Tyr、Lys和Gln的羧端肽鍵且相對大的氨基酸側(cè)鏈的肽鍵；中性蛋白酶可以水解羧端為Tyr、Phe、Trp等芳香族氨基酸的肽鍵；復(fù)合蛋白酶為一種溫和的蛋白質(zhì)內(nèi)切酶，對酰胺基的水解能力較弱；風(fēng)味蛋白酶的作用較為廣泛，而木瓜蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶類，能裂解堿性氨基酸、亮氨酸或甘氨酸的肽鍵。由圖1可知，木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的水解度較大，而中性蛋白酶的水解度最小，可能是因為鴨蛋卵清蛋白中的Glu、Leu、Lys和Gly含量較高，而芳香族氨基酸含量偏低，從而導(dǎo)致這種結(jié)果。木瓜蛋白酶可以特異性水解鴨蛋卵清蛋白中的肽鍵，從而可以釋放出更多的α-氨基酸，因而其產(chǎn)物的水解度最高。

2.3 單因素實驗結(jié)果

2.3.1 酶解時間的篩選由圖2可知，隨著酶解時間的延長，水解度呈現(xiàn)先上升后逐漸平緩的趨勢，且當(dāng)時間到達(dá)5 h后，水解度達(dá)到了 （24.74±0.63）%，隨著酶解時間延長水解度未顯著升高（P＜0.05），推測其原因是酶具有專一性，隨著酶解時間的延長，特定位點的肽鏈已經(jīng)大部分水解，因而水解度不會隨著時間的無限延長而不斷增加。因此后續(xù)選取4、4.5、5 h展開正交實驗，探究最佳的酶解時間。

圖1 5種蛋白酶對水解度的影響Fig.1 Effect of five proteases on hydrolysis degree

圖2 酶解時間對水解度的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree

2.3.2 加酶量的篩選由圖3可知，加酶量對水解度的影響趨勢和酶解時間類似，呈現(xiàn)出先增加后平緩的趨勢，當(dāng)加酶量為4×104U/（g·min）時，水解度為（27.40±0.71）%，隨著加酶量的增加，水解度基本保持不變，說明此時體系中底物與酶結(jié)合位點已經(jīng)接近飽和，只增加體系中蛋白酶的量不能提高上清液中肽的水解度，也會造成資源的浪費。因此后續(xù)選擇3.5×104、4.0×104U/（g·min）和4.5×104U/（g·min）進(jìn)行正交實驗，探究最適宜的加酶量。

2.3.3 酶解溫度的篩選酶解溫度也是影響酶解效率的條件之一，由圖4可知，當(dāng)酶解溫度在40～60℃之間變化時，水解度先增加后降低，在50℃時水解度達(dá)到最高為（25.81±0.65）%，與李艷紅[19]報道的木瓜蛋白酶最適溫度55℃相符。因此后續(xù)設(shè)定45、50℃和55℃進(jìn)行正交實驗，探究最佳實驗條件。

圖3 加酶量對水解度的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on hydrolysis degree

圖4 酶解溫度對水解度的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree

2.3.4 酶解pH的篩選木瓜蛋白酶的最適pH為6.00～7.00，所以本研究中選擇pH 5.00～8.00進(jìn)行探究。由圖5可知，木瓜蛋白酶的水解度隨著pH的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)pH為6.50時水解度達(dá)到最高為（26.32±1.75）%，為探究最適宜酶解pH，選擇pH值6.20、6.40和6.60進(jìn)行正交實驗。

圖5 酶解pH對水解度的影響Fig.5 Effect of pH on hydrolysis degree

2.4 正交實驗結(jié)果與分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，對酶解時間、加酶量、酶解溫度和酶解pH展開L9（34）正交試驗，探究最優(yōu)水平，正交試驗設(shè)計見表2，鴨蛋卵清蛋白酶解正交試驗結(jié)果見表4。

由表4可知，通過正交試驗結(jié)果的極差分析可知對水解度影響大小排序為A＞B＞C＞D，最優(yōu)解A3B3C3D2，即通過正交試驗得出木瓜蛋白酶的最佳水解條件為，水解時間為5.5 h，加酶量為4.5×104U/（g·min），酶解溫度為55℃，酶解pH 6.40。采取此條件進(jìn)行驗證實驗，經(jīng)驗證此條件下木瓜蛋白酶水解鴨蛋卵清蛋白的水解度為（27.91±0.57）%，表明該優(yōu)化取得了較好的效果。后續(xù)實驗均采用此優(yōu)化結(jié)果制備鴨蛋卵清蛋白木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物（HD），并進(jìn)行進(jìn)一步分析。

表4 正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal test results

2.5 HD的相對分子質(zhì)量分布

采用高效液相色譜法進(jìn)行酶解產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布測定，利用標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間與lg（Mw）做線性回歸方程：y=-0.204 2x+6.790 6，R2=0.974 6。標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的高效滲透色譜圖見圖6。因此可求得鴨蛋卵清蛋白在經(jīng)過木瓜蛋白酶水解后相對分子質(zhì)量分布范圍為：Mw＜300占33.71%、300＜Mw＜450占29.21%、450＜Mw＜1 450占20.42%、1 450＜Mw＜6 500占0.49%、6 500＜Mw＜12 500占5.05%、Mw＞12 500占11.12%。其 中Mw＜1 450的 比 例 為83.35%，表明鴨蛋卵清蛋白經(jīng)過木瓜蛋白酶水解后產(chǎn)生了較多的小分子肽段，而Doucet D[31]報道水解度大小和低相對分子質(zhì)量肽段比例存在正相關(guān)，與本實驗結(jié)果相符。本實驗中采用優(yōu)化后的條件進(jìn)行卵清蛋白的酶解，卵清蛋白中的多肽片段被盡可能地分解，推測其原因是采用木瓜蛋白酶水解5.5 h后，卵清蛋白中的多肽鏈被分解，從而使得產(chǎn)物中小分子肽段比例增加，因而產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布大部分在1 500以下。

圖6 HD的高效凝膠滲透色譜圖Fig.6 High performance gel permeation chromatography of HD

2.6 HD的免疫活性評價

多肽的免疫活性已經(jīng)被一些文獻(xiàn)報道，Wu[32]報道了利用5種蛋白酶酶解脫脂麥胚谷蛋白，其中堿性蛋白酶水解產(chǎn)物具有更好地促進(jìn)脾細(xì)胞增殖、吞噬中性紅和促進(jìn)細(xì)胞因子分泌的能力，Songyi Lin[33]報道了松子仁蛋白肽在3 000～10 000的產(chǎn)物PNMPP可增強(qiáng)ICR小鼠的先天性免疫和適應(yīng)性免疫。如圖7所示，經(jīng)過HD處理24 h的小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7的上清液中NO、TNF-α和IL-6的含量均顯著高于空白組，說明以促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7參與并促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)，顯示出一定的免疫活性，從而顯示出具有一定的免疫活性。在圖7（a）中，當(dāng)采用250μg/mL的HD處理細(xì)胞時，其NO分泌量達(dá)到了（42.37±1.05）μmol/L，是空白組的1.5倍，而在圖7（b）（c）中，TNF-α、IL-6分泌量分別達(dá)到了（854.77±12.13）pg/mL和（367.51±5.93）pg/mL，分別是空白組的4.09倍和2.39倍，均達(dá)到顯著水平（p＜0.01），表明HD在250μg/mL時即可刺激巨噬細(xì)胞分泌促炎因子，激發(fā)機(jī)體內(nèi)非特異性免疫。當(dāng)HD質(zhì)量濃度達(dá)到1 000μg/mL時，3種細(xì)胞因子NO、TNF-α和IL-6分泌量分別達(dá)到陽性對照LPS（20μg/mL）的87.94%、59.10%和73.53%，推測HD可能具有類似于脂多糖的抗原性，但是相對于脂多糖其引起的非特異性免疫反應(yīng)又較溫和，可能是一種潛在的免疫調(diào)節(jié)劑。

圖7 HD的免疫活性Fig.7 Immunological activity of HD

2.7 HD對AAPH誘導(dǎo)的紅細(xì)胞溶血的保護(hù)

AAPH可以在37℃熱分解產(chǎn)生烷基自由基，遇到氧氣時會被氧化形成氫過氧自由基。氫過氧自由基可以攻擊細(xì)胞膜與磷脂反應(yīng)引起脂質(zhì)過氧化從而破壞細(xì)胞膜的完整性，使紅細(xì)胞溶血，因此可以通過測定溶血抑制率間接反應(yīng)樣品的體外抗氧化活性。

如圖8所示，加入1 000μg/mL樣品的毒性組與不加AAPH的正常組的抑制率均在80%以上，且無顯著性差異（P＜0.05），表明HD對人紅細(xì)胞無損傷作用，可以進(jìn)行后續(xù)實驗。由圖8可知，加入HD后的樣品組（樣品+AAPH）中紅細(xì)胞溶血抑制率上升，且隨著質(zhì)量濃度增加溶血抑制率也顯著增加（P＜0.05）。HD質(zhì)量濃度達(dá)到1 000μg/mL時，其溶血抑制率為（53.95±1.82）%，溶血抑制率為空白組（只加PBS）的0.67倍，為AAPH損傷組（PBS+AAPH）的1.41倍，表明HD具有一定的紅細(xì)胞溶血抑制作用。與Chen[34]的實驗結(jié)果相比，HD在1 000μg/mL時的紅細(xì)胞溶血抑制率與純化后的SLT-3多糖在750μg/mL時的紅細(xì)胞溶血抑制率相當(dāng)，表明HD具有清除氫過氧自由基的能力。

圖8 不同質(zhì)量濃度的HD對紅細(xì)胞溶血的抑制作用Fig.8 Inhibition of HD for erythrocyte hemolysis at different concentrations

2.8 HD的體外抗氧化活性評價

HD的體外抗氧化活性評價如圖9所示。當(dāng)HD的質(zhì)量濃度為1 000μg/mL時，其DPPH、ABTS+·自由基清除率分別為（31.90±0.54）%和（86.41±2.12）%，均顯著高于空白組（P＜0.05），當(dāng)HD質(zhì)量濃度達(dá)到125μg/mL時，其ABTS+·自 由 基 清 除 能 力 與100μmol/L的Trolox無顯著性差異（P＜0.05），表明HD在125μg/mL時ABTS+·自由基清除能力與100 μmol/L的Trolox相當(dāng)。分析其原因可能是HD中小分子多肽含量較高，其在水相體系中溶解度很好，因而具有較好的清除自由基能力。HD的ORAC值經(jīng)換算為0.357 4μmol/mg，與Pádraigín A[35]的微藻多肽的ORAC值相當(dāng)，表明HD還具有清除烷氧自由基的能力。但是HD的DPPH自由基清除率較小，可能是因為鴨蛋卵清蛋白經(jīng)過木瓜蛋白酶酶解后，其中的高相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)被分解為親水性的小肽以及游離的氨基酸，極性增加，使其難以捕捉疏水性的DPPH自由基[36]。綜合以上實驗數(shù)據(jù)，表明HD具有一定的體外抗氧化活性。

圖9 HD的體外抗氧化活性評價Fig.9 Evaluation of in vitro antioxidant activity of HD

3 結(jié)語

本實驗中探究了鴨蛋卵清蛋白的酶解條件，先以水解度為指標(biāo)比較5種蛋白酶的水解效率，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶能特異性裂解鴨蛋卵清蛋白中Leu和Gly等堿性氨基酸間的肽鍵，具有最好的水解效果，再利用正交試驗探究木瓜蛋白酶水解的最佳條件，采用了L9（34）實驗比較了酶解時間、加酶量、酶解溫度和酶解pH對水解度的影響，最佳條件為：水解時間為5.5 h，加酶量為4.5×104U/（g·min），酶解溫度為55℃，酶解pH 6.40。經(jīng)驗證此條件下水解度為27.91%，并以此為條件制備成鴨蛋卵清蛋白酶解產(chǎn)物（HD）進(jìn)行后續(xù)實驗。

采用液相色譜法對HD進(jìn)行相對分子質(zhì)量分布區(qū)間表征，有如下分布：0＜Mw＜300、33.71%，300＜Mw＜450、29.21%，450＜Mw＜1 450、20.42%，1 450＜Mw＜6 500、0.49%，6 500＜Mw＜12 500、5.05%，Mw＞12 500、11.12%。相對分子質(zhì)量分布數(shù)據(jù)表明鴨蛋卵清蛋白經(jīng)過木瓜蛋白酶5.5 h水解后，Mw＜1 450的部分占83.35%，結(jié)果表明HD中小分子肽含量較多，與本實驗以水解度為指標(biāo)進(jìn)行酶解方案篩選有一定的關(guān)系，并推測小分子多肽含量高的HD可能具有一定的體外抗氧化活性和免疫調(diào)節(jié)活性。

本實驗對HD的免疫活性和體外抗氧化活性進(jìn)行了進(jìn)一步的探究。當(dāng)采用250μg/mL的HD刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7時，其NO、TNF-α和IL-6分泌量分別達(dá)到了空白組的1.5倍、4.09倍和2.39倍，均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），表明HD在較低質(zhì)量濃度下即可刺激細(xì)胞分泌促炎因子激發(fā)機(jī)體內(nèi)非特異性免疫。HD對AAPH誘導(dǎo)損傷的紅細(xì)胞溶血抑制實驗顯示，1 000μg/mL的HD對細(xì)胞無毒害作用，其溶血抑制率為（53.95±1.82）%，為空白組的0.67倍，為AAPH損傷組的1.41倍，表明HD可以保護(hù)羊紅細(xì)胞免受AAPH產(chǎn)生的氫過氧自由基的攻擊，顯示出一定的體外抗氧化能力。本實驗中還采用化學(xué)法對HD的體外抗氧化活性進(jìn)行了評價，結(jié)果顯示當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為1 000μg/mL時，其DPPH和ABTS+·自由基清除率分別為（31.90±0.54）%和（86.41±2.12）%，ORAC值為0.357 4μmol/mg，其DPPH自由基清除率較低可能是因為本實驗中獲得的多肽相對分子質(zhì)量較小，在DPPH體系中難以捕捉疏水性自由基?；钚蕴骄繉嶒灡砻鼬喌奥亚宓鞍酌附猱a(chǎn)物具有較好的免疫活性和體外抗氧化活性， 也為鴨蛋的開發(fā)利用提供了理論支撐。