釀酒糟醅中生香酵母的篩選及培養(yǎng)條件

趙志軍，王瑞卿，劉延波，劉 寧，王洪彬，孫西玉，4，潘春梅*

（1.河南牧業(yè)經濟學院 食品與生物工程學院（酒業(yè)學院），河南 鄭州450046；2.河南牧業(yè)經濟學院 河南省白酒風格工程技術研究中心，河南 鄭州450046；3.賒店老酒股份有限公司，河南 社旗473300；4.河南張弓老酒酒業(yè)有限公司，河南 寧陵476733）

我國濃香型白酒采用泥窖續(xù)糟，固態(tài)發(fā)酵工藝，歷來有“千年老窖，萬年糟”的說法。糟醅的質量對濃香型白酒的釀造起著非常重要的作用[1]。糟醅是已發(fā)酵完畢等待蒸餾的物料[2]，是釀酒微生物代謝發(fā)酵的主要場所。微生物在其中進行糖化、酒化、酸化和酯化等一系列生化反應過程[3]，所以糟醅中的微生物品質影響著出酒率的高低和酒質的優(yōu)劣[1]。

酵母作為糟醅發(fā)酵的主要功能菌之一，依據(jù)其功能可分為釀酒酵母和生香酵母[4-5]。釀酒酵母具有較強的產酒精能力，代謝產物主要是酒精。生香酵母對酸、醇有較強的酯化能力，產生的香氣物質以酯類為主，還有醇類、酸類、醛類、酮類、胺類、芳香族類等[6-7]。這些香味物質是產生酒體芳香及促進酒體豐滿的關鍵化合物[8]。現(xiàn)已報道的生香酵母包括異常漢遜酵母[9]、假絲酵母[10]、畢赤酵母[11]、異常威克漢姆酵母[12]等。作者旨在從賒店老酒的糟醅中分離得到優(yōu)良的產酯酵母菌菌株，并采用響應面法對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以期將其培養(yǎng)液投入窖池，為提高濃香型白酒基酒的質量奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料來源釀酒糟醅：賒店老酒股份有限公司提供。

1.1.2 實驗試劑蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉等常規(guī)試劑：均購自北京奧博星生物技術有限責任公司；青霉素：購自華北制藥集團動物保健品有限責任公司。

1.1.3 篩選培養(yǎng)基PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉3 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L。

1.1.4 活化培養(yǎng)基YEPD液體培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L。

1.1.5 發(fā)酵產酯培養(yǎng)基豆芽汁培養(yǎng)基：黃豆芽10 g，葡萄糖5 g，水100 mL。將新鮮黃豆芽洗干凈，小火煮沸0.5 h，用紗布過濾，補足水分。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2F超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司產品；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠制造；GH-500隔水式培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司產品；ZQLY-300S搖床：上海知楚儀器有限公司產品；恒溫水浴鍋：常州方科儀器有限公司產品。

1.3 方法

1.3.1 生香酵母的初篩稱取10 g混勻的糟醅于90 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，搖床28℃、120 r/min，培養(yǎng)24 h。用移液槍吸取菌懸液1 mL至9 mL無菌水中，并依次梯度稀釋至1×10-6倍，取稀釋度1×10-4、1×10-5、1×10-6的菌懸液各0.1 mL均勻涂布于添加80 mg/L青霉素的PDA固體培養(yǎng)基表面，置于28℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取長勢良好的單菌落劃線轉接到PDA培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)72 h，長出的單菌落再次劃線至完全純化，斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 生香酵母的復篩對初篩保存的菌株進行活化復篩。每支保存的斜面試管菌種，挑取一環(huán)接種至YEPD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h，制成種子液。將制備好的種子液以體積分數(shù)2%接種量接種于裝有100 mL發(fā)酵產酯培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，恒溫搖床28℃、120 r/min條件下培養(yǎng)5 d，測定總酯產量（質量濃度）。

1.3.3 總酯的測定總酯測定方法采用皂化中和滴定法[13]。

1.3.4 菌株鑒定

1）菌株形態(tài)學鑒定及生理生化試驗 菌落形態(tài)觀察：將被檢菌用稀釋平板法在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落的顏色、大小、表面形態(tài)、邊緣形態(tài)、質地等并做記錄。

細胞形態(tài)鑒定：將平板上的菌落用接種針挑取一環(huán)制片，在顯微鏡下觀察。

初步生理生化試驗按照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[14]進行，主要包括糖發(fā)酵實驗、硝酸鹽利用實驗、類淀粉物質生成實驗、脲酶實驗等。

2）菌株26S rDNA鑒定 使用酵母DNA基因組快速提取試劑盒提取酵母基因組DNA，酵母擴增引物為通用引物對NL1和NL4。反應體系為50μL（San Taq PCR Mix預混液25μL，引物各2μL，DNA模板2μL，ddH2O 19μL）。PCR擴增條件：94℃，5 min；94℃，40 s，53℃，45 s，72℃，45 s，35個 循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取3μL PCR產物經1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測產量和特異性，將PCR產物送交上海生物生工有限公司進行測序，將測序所得特定序列，在NCBI上通過BLAST程序進行同源性比較與分析，用MEGA6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 篩選酵母培養(yǎng)條件的研究

1）初始pH對篩選酵母產酯量（質量濃度）的影響 為了確定篩選酵母適宜培養(yǎng)的初始pH，用0.1 mol/L的鹽酸調節(jié)豆芽汁培養(yǎng)基的pH值，分別至3、4、5、6、7，接種所篩選得到的酵母，在28℃、120 r/min條件下，培養(yǎng)5 d，進行小型發(fā)酵試驗，測定發(fā)酵液中總酯質量濃度。

2）初始糖質量濃度對篩選酵母產酯量的影響調節(jié)豆芽汁培養(yǎng)基的初始糖質量濃度分別為2、4、6、8、10 g/dL。恒溫搖床28℃、120 r/min條件下培養(yǎng)5 d，發(fā)酵結束后測發(fā)酵液總酯質量濃度。

3）發(fā)酵時間對篩選酵母產酯量的影響 用豆芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選出的酵母菌株，在28℃、120 r/min條件下培養(yǎng)。選取發(fā)酵開始后的第2、3、4、5、6、7天分別取樣測的發(fā)酵液總酯質量濃度。

1.3.6 響應面實驗在單因素實驗的基礎上，選取相關性大的3個因素為自變量，以總酯的產量（質量濃度）為指標進行17組5個中心點的Box-Behnken響應面分析[15-17]，每個因素均設3個平行。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理運用Excel 2013和Design-Expert 8.0.6軟件對實驗結果進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 生香酵母的篩選結果

通過在PDA瓊脂平板上多次分離純化后，共分離出22株疑似酵母菌的菌株（菌落編號S1—S22），將純化的22株菌株進行篩選，其產酯結果見表1。由表1得到，在相同的培養(yǎng)條件下，酵母菌株S5發(fā)酵液總酯質量濃度為4.67 g/L，產酯能力強，是比較理想的產酯酵母。因此，選用S5菌株進行后續(xù)試驗研究。

2.2 生香酵母鑒定結果

2.2.1 菌株形態(tài)和生理生化試驗結果對菌株S5進行菌落形態(tài)觀察，并劃線于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征，結果見圖1。菌株S5在PDA瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，邊緣整齊，表面光滑，中央凸起，有水果香氣。通過生理生化試驗，該菌株能發(fā)酵葡萄糖，能利用硝酸鹽，不能生成類淀粉物質，能水解尿素。

表1 不同菌株發(fā)酵液中總酯產量Table 1 Total ester contents in fermentation broth of different strains

圖1 菌株S5的菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of strain S5

2.2.2 菌株的分子鑒定對菌株S5的26S rDNA的PCR擴增產物進行序列測序。將測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，對比結果顯示S5菌株與現(xiàn)已有的異常威克漢姆酵母的同源性達100%，利用MEGA6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。結合S5的形態(tài)，生理生化試驗結果以及S5的系統(tǒng)發(fā)育樹，可以確定S5為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

2.3 初始pH對篩選酵母產酯量影響的結果

根據(jù)1.3.5中設定的發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值進行小型發(fā)酵試驗，結果見圖3。隨著初始pH的升高，發(fā)酵液中總酯質量濃度顯著提高，pH為5時達到最大，然后隨pH升高發(fā)酵液中總酯的質量濃度有所下降。說明該菌株在pH為5～6的培養(yǎng)基中有較好的產酯能力，尤其是在pH為5的時候達到最高，總酯質量濃度為4.15 g/L。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree

圖3 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對產酯量的影響Fig.3 Effect of initial pH of fermentation medium on the production of ester

2.4 初始糖質量濃度對篩選酵母產酯量影響的結果

根據(jù)1.3.5中設定的發(fā)酵液初始糖質量濃度，進行小型發(fā)酵試驗，結果見圖4。隨著發(fā)酵液初始糖質量濃度的增加，發(fā)酵液總酯質量濃度是先上升后下降。葡萄糖添加量為6 g/dL時總酯質量濃度達4.13 g/L，表明菌株發(fā)酵產酯的最佳初始糖質量濃度為葡萄糖添加量為6 g/dL。當培養(yǎng)基的初始糖質量濃度過高，培養(yǎng)基滲透壓會增大，影響生香酵母的產酯能力。

2.5 發(fā)酵時間對篩選酵母產酯量影響的結果

發(fā)酵時間對產酯量的影響見圖5。由圖5可知，發(fā)酵3 d時總酯質量濃度最高，達到4.55 g/L。但隨著發(fā)酵時間的增長，發(fā)酵液的總酯質量濃度下降與廖永紅等[18]在對3種產酯酵母總酯的生成特性研究時發(fā)現(xiàn)的結論一致，其可能原因是隨發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中難揮發(fā)性酯類也逐漸轉變?yōu)橐讚]發(fā)性酯類或其他物質所致，因此S5生成總酯的適宜發(fā)酵時間為3 d。

圖4 初始糖度對產酯量的影響Fig.4 Effect of initial sugar content on ester yield

圖5 不同發(fā)酵時間對總酯生成量的影響Fig.5 Effect of different fermentation time on total ester production

2.6 響應面的結果與分析

2.6.1 回歸模型建立及方差分析在單因素的基

礎上，選取培養(yǎng)基初始pH（A），發(fā)酵時間（B），培養(yǎng)基初始糖質量濃度（C）3個對產酯影響顯著的因素為自變量，以總酯質量濃度為響應值，進行響應面試驗。試驗設計及試驗結果見表2。

表2 響應面設計及其結果Table 2 Response surface design and the results

通過響應面分析軟件（Design-Expert8.0.6）對表2中的數(shù)據(jù)進行分析，得到數(shù)學模型，并對數(shù)學模型進行方差分析，得到模型和回歸系數(shù)的顯著性，結果見表3。

對因素進行二次回歸擬合分析，建立顯著因素的擬合方程：

Y=7.74-0.32A+0.19B+0.58C-0.049AB+0.11AC-0.094BC-2.88A2-2.77B2-2.47C2

由表3可知，響應面模型極其顯著，其模型的回歸系數(shù)為99.11%，R2adj為97.97%。說明該模型模擬度較好可以用此模型來預測該菌株的產酯能力。失擬項不顯著（P＞0.01），說明本試驗所得二次回歸方程能夠很好地對響應值進行預測。在此模型中A2、B2、C2的P值均小于0.01，說明該菌株發(fā)酵過程中發(fā)酵液的初始pH、培養(yǎng)時間和發(fā)酵液的初始糖質量濃度對產酯的影響是非常顯著的。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.6.2 響應曲面分析當各因素大小從四周逐漸趨向中心點時，曲面圖呈凸起趨勢，說明相關因素交互作用越強，即菌株發(fā)酵產酯能力趨向最大化，說明存在最大響應值[19]。由圖6（a）可以發(fā)現(xiàn)，當初始糖質量濃度一定時，pH和發(fā)酵時間的值由小變大時，曲線出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。圖6（b）、（c）也出現(xiàn)當某一因素一定時，其余2種因素的圖像也呈先上升后下降的趨勢，說明該模型因素之間的相互作用較強，存在最大響應值。運用軟件Design-Expert 8.0.6對結果進行分析，得到在pH為4.95，發(fā)酵時間為3.03 d，初始糖質量濃度為6.23 g/dL時發(fā)酵液中總酯質量濃度達到最大，為7.78 g/L。考慮到實際情況，調整發(fā)酵時間為3 d，初始糖質量濃度為6 g/dL進行驗證試驗。結果顯示，3次重復試驗中總酯質量濃度均值為7.67 g/L，與理論值的誤差較小，說明優(yōu)化出的產酯條件可靠，具有實用價值。

圖6 響應面三維立體圖Fig.6 Response surface（3D）diagram

3 結語

作者通過從糟醅中分離篩選得到一株產酯能力較好的菌株S5，在28℃、120 r/min的條件下培養(yǎng)5 d，產酯培養(yǎng)基中總酯質量濃度達4.67 g/L。經過形態(tài)學觀察，生理生化及分子生物學鑒定，確定菌株為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。在單因素實驗的基礎上，通過響應面法對菌株S5的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，得到該菌株最適發(fā)酵產酯條件為pH 4.95，發(fā)酵時間3 d，初始糖質量濃度6 g/dL。在此條件下，該菌株發(fā)酵液總酯質量濃度為7.67 g/L，與預測值7.78 g/L的相對誤差僅為1.4%，產酯量比未優(yōu)化之前提高了64.2%。此前王鵬昊[20]報道從工業(yè)化小曲中分離出1株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），該酵母總酯產量達4.065 g/L。綜合比較，本實驗篩選出的異常威克漢姆酵母在優(yōu)化后其發(fā)酵液總酯質量濃度達7.67 g/L，說明該菌株產酯量較高，在白酒發(fā)酵時該菌株能提高酒中酯類物質的質量濃度，提升濃香型白酒的品質。

該研究得到的產酯能力較好的酵母菌菌株是從實際生產用釀酒糟醅中分離獲得，能夠適應生產環(huán)境。應用響應面法優(yōu)化提高了該菌株的產酯能力，更有利于在生產環(huán)節(jié)中的應用。雖然該研究是在實驗室條件下完成并獲得的實驗數(shù)據(jù)，與實際生產會有一定的差異，但考慮到該菌株本身來自生產所用糟醅，能夠適應各種發(fā)酵因素對其的影響。若將其擴大培養(yǎng)投入釀酒糟醅中，對提高原酒中酯類含量以及成品酒酒質必然會有一定的幫助。該研究中所篩選出的酵母菌株為進一步在實踐中的應用奠定了基礎。