肉桂精油乳液的制備及抑菌性

汪師帥，朱 蝶

（武漢商學(xué)院 食品科技學(xué)院，湖北 武漢430056）

肉桂精油是從桂皮、桂葉、桂枝等部位提取而得，為琥珀色液體，香氣強(qiáng)烈持久。肉桂醛是肉桂精油的主要成分，難溶于水和甘油，易溶于醇和醚類物質(zhì)，能隨水蒸氣揮發(fā)，導(dǎo)致肉桂精油在食品中很難穩(wěn)定存在[1]。肉桂醛也易發(fā)生化學(xué)降解，導(dǎo)致香味丟失，并產(chǎn)生異味，在一定程度上限制了應(yīng)用[2]。

肉桂醛的抑菌性良好，對(duì)細(xì)菌、真菌等微生物具有較強(qiáng)的抑制作用。肉桂醛能夠使細(xì)菌的細(xì)胞膜破裂，使細(xì)菌在細(xì)胞分裂時(shí)產(chǎn)生畸變和異常分裂，從而對(duì)細(xì)菌的正常生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生直接的抑制作用，導(dǎo)致其外觀形態(tài)發(fā)生明顯變化。此外，肉桂醛還能與細(xì)菌DNA發(fā)生相互作用，影響細(xì)菌DNA的正常合成，并能夠改變細(xì)菌內(nèi)部的離子平衡，導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生解體而死亡[3]。

作者通過(guò)將肉桂精油制備成水包油型乳液，一方面探討了該乳液對(duì)離心轉(zhuǎn)速、溫度以及儲(chǔ)藏時(shí)間的穩(wěn)定性；另一方面通過(guò)改變?nèi)橐褐腥夤鹁偷馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)，獲得一系列不同粒徑分布的乳液液滴。在此基礎(chǔ)上，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對(duì)象，探討乳液的粒徑大小與其抑菌效果的相關(guān)性。本研究可為肉桂精油在食品加工中的有效應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂精油：深圳市鼎誠(chéng)植物香料有限公司產(chǎn)品；中鏈脂肪酸（MCT，食品級(jí)）：武漢博星化工有限公司產(chǎn)品；吐溫80、司班20（分析純）：上海申宇醫(yī)藥化工有限公司產(chǎn)品；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基，含有胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L）：上海博微生物科技有限公司產(chǎn)品。

大腸桿菌（Escherichia coli）與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心。

1.2 儀器

DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；CJJ78-1電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Zetasizer nano ZS納米粒度分析儀：英國(guó)馬爾文儀器公司產(chǎn)品；TG16-WS高速冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；JY92-IIN紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；YXQ-50SII壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅有限公司產(chǎn)品；HCY-123C恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 肉桂精油乳液的制備

稱取一定量的肉桂精油與MCT混合均勻，逐滴加入含有乳化劑的水中。整個(gè)實(shí)驗(yàn)在50℃水浴條件下進(jìn)行，持續(xù)15 min。在乳液體系中，固定油相總體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，乳化劑（司班20∶吐溫80=1∶3，質(zhì)量比）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%。為了得到不同粒徑的乳液，可通過(guò)改變?nèi)夤鹁偷奶砑恿?，使肉桂精油占整個(gè)乳液體系的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%。

1.4 乳液的粒徑及PDI測(cè)定

采用納米粒度儀Zetasizer nano ZS測(cè)定肉桂精油乳液的平均粒徑及多分散系數(shù)PDI值，參數(shù)設(shè)置為溫度25℃，散射角173°，折射率1.453。為降低多重光散射效應(yīng)，測(cè)定前需用去離子水稀釋溶液。實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)定3次取平均值，采用d4，3即體積平均粒徑表征乳液粒徑的大小。

1.5 肉桂精油乳液的穩(wěn)定性測(cè)定

離心穩(wěn)定性：將質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%肉桂精油乳液于2 000～12 000 r/min的條件下離心12 min，觀察乳液是否分層。若無(wú)分層，測(cè)定其粒徑及PDI大小。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。

熱穩(wěn)定性：將質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%肉桂精油乳液分別放置在4、25、40、60、80℃的條件下處理30 min，測(cè)定其粒徑及PDI大小。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

儲(chǔ)藏穩(wěn)定性：將肉桂精油乳液放置于4℃和25℃條件下儲(chǔ)藏不同時(shí)間。每隔一段時(shí)間取樣，測(cè)定其粒徑及PDI大小。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.6 乳液的抑菌性測(cè)定

乳液的處理：以無(wú)菌水為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組為T(mén)-0.5%、T-1.5%、T-2.5%，分別對(duì)應(yīng)乳液中肉桂精油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.5%、2.5%。為了保證乳液中肉桂精油的質(zhì)量相同，用無(wú)菌水將T-1.5%、T-2.5%分別稀釋3倍和5倍，獨(dú)立探討不同粒徑的乳液對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制情況。

菌懸液的制備：用接種環(huán)從肉湯瓊脂斜面上挑取一環(huán)活化后的受試菌至LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24 h得菌懸液。

動(dòng)態(tài)抑菌曲線的制作：用移液槍準(zhǔn)確吸取200μL菌懸液于離心管中，再加入1 800μL乳液或無(wú)菌水，混勻，靜置0.5 h后放置于37℃培養(yǎng)。每隔一定的時(shí)間取樣，測(cè)定樣品在600 nm處的吸光度。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.5軟件進(jìn)行平均值和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)乳液粒徑及PDI的影響

肉桂精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)乳液粒徑及PDI值的影響，如圖1所示。當(dāng)肉桂精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.5%增大至2.0%，乳液粒徑迅速?gòu)募s50 nm上升至270 nm。隨著精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增加至2.5%，乳液粒徑增加緩慢。PDI值是反應(yīng)乳液均一性的重要指標(biāo)。PDI值越小，乳液體系均一越好[4]。圖中PDI值先減小后增大，在肉桂精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)，PDI值達(dá)到最小，約為0.1。肉眼觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜1%，乳液澄清透明，泛微藍(lán)色乳光。當(dāng)精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥1%，乳液呈現(xiàn)均一的乳白色。乳液外觀的差異是乳液液滴與光線作用的結(jié)果。當(dāng)液滴直徑遠(yuǎn)大于入射光波長(zhǎng)時(shí)，主要發(fā)生光的反射，伴隨光的折射、吸收和散射，呈現(xiàn)乳白色、不透明的外觀；當(dāng)液滴直徑稍大于入射光波長(zhǎng)時(shí)，則有光的散射現(xiàn)象發(fā)生，體系呈半透明狀；當(dāng)液滴直徑小于入射光波長(zhǎng)時(shí)，光可完全透過(guò)，此時(shí)乳狀液呈透明狀。因此，可從乳液外觀粗略判斷乳液粒徑大小[5]。

圖1 肉桂精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)乳液粒徑及PDI值的影響Fig.1 Effect of cinnamon oil concentration on particlesize and PDI value of emulsion

2.2 肉桂精油乳液的離心穩(wěn)定性

穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)乳液質(zhì)量非常重要的指標(biāo)，也決定了乳液的儲(chǔ)藏條件、應(yīng)用范圍及有效期限[6]。如若乳液體系的穩(wěn)定性差，在儲(chǔ)藏過(guò)程中會(huì)發(fā)生乳液液滴聚集，出現(xiàn)絮凝分層現(xiàn)象。該現(xiàn)象出現(xiàn)的快慢可評(píng)判乳液穩(wěn)定性的差異。此部分通過(guò)離心這一物理方式可加速這一變化，來(lái)表征乳液的穩(wěn)定性。

實(shí)驗(yàn)中控制乳液中各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為肉桂精油1.5%，MCT 3.5%，乳化劑10%，水85%，制備得到乳液，比較乳液經(jīng)離心處理后粒徑及PDI值的變化，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)過(guò)不同轉(zhuǎn)速（2 000～12 000 r/min）處理后，乳液的粒徑基本維持在130 nm附近。離心轉(zhuǎn)速的差異并不會(huì)導(dǎo)致乳液的粒徑發(fā)生明顯變化。然而，乳液PDI值隨著離心轉(zhuǎn)速增加而略微上升，說(shuō)明高離心轉(zhuǎn)速會(huì)導(dǎo)致乳液的均一性稍有下降。此外，通過(guò)肉眼觀察發(fā)現(xiàn)乳液經(jīng)不同轉(zhuǎn)速離心后，均未出現(xiàn)絮凝分層現(xiàn)象。由此可見(jiàn)該乳液具有較好的離心穩(wěn)定性，體系穩(wěn)定性較好。

圖2 離心轉(zhuǎn)速對(duì)乳液粒徑及PDI值的影響Fig.2 Effect of centrifugal speed on particle size and PDI value of emulsion

2.3 肉桂精油乳液的熱穩(wěn)定性

為了探究此肉桂精油乳液在應(yīng)用及儲(chǔ)藏時(shí)的溫度條件，此部分實(shí)驗(yàn)將肉桂精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的乳液放置于不同溫度條件（4～80℃）下處理30 min，來(lái)判斷乳液對(duì)熱的穩(wěn)定性。從圖3可見(jiàn)，當(dāng)溫度低于40℃，乳液的粒徑及PDI值基本不發(fā)生變化，粒徑維持在130 nm，PDI維持在0.1。而在60、80℃條件下，乳液的粒徑及PDI值陡然增加。表明高溫會(huì)破壞乳液體系的穩(wěn)定性。林麗萍等[7]利用司班和吐溫系列乳化劑所制備的肉桂醛乳液在（54±1）℃條件下，貯存14 d后，出現(xiàn)了油析和白色沉淀。

圖3 溫度對(duì)乳液粒徑及PDI值的影響Fig.3 Effect of temperature on particle size and PDI value of emulsion

此外，通過(guò)肉眼觀察還發(fā)現(xiàn)乳液經(jīng)過(guò)80℃處理后發(fā)生明顯的分層現(xiàn)象。待此樣品冷卻，搖晃，樣品又恢復(fù)均一的乳白色。司班20和吐溫80屬非離子型乳化劑，當(dāng)溫度較高時(shí)，乳化劑在水中的溶解度迅速降低而析出，體系發(fā)生分層現(xiàn)象。該現(xiàn)象稱為起曇，溫度為曇點(diǎn)。當(dāng)環(huán)境溫度低于曇點(diǎn)時(shí)，體系恢復(fù)澄清[8]。

2.4 肉桂精油乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

為了探究此肉桂精油乳液的有效使用期限，此部分實(shí)驗(yàn)將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的肉桂精油乳液置于4、25℃恒溫條件下儲(chǔ)藏不同時(shí)間，以乳液的粒徑為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性，結(jié)果如圖4所示。在4℃條件下，儲(chǔ)藏1～5 d，各質(zhì)量分?jǐn)?shù)的肉桂精油乳液均能保持穩(wěn)定，乳液粒徑基本維持不變。在儲(chǔ)藏第10天，各組乳液粒徑均會(huì)發(fā)生不同程度地增加。高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的肉桂精油（2.5%），乳液粒徑從第7天開(kāi)始增加。相比于4℃條件下所得結(jié)果，乳液在25℃條件下儲(chǔ)藏穩(wěn)定性可延長(zhǎng)至10 d。如圖4（b）所示，在儲(chǔ)藏第10天，各質(zhì)量分?jǐn)?shù)精油的乳液粒徑開(kāi)始略微增加。由此可見(jiàn)，25℃更有利于該肉桂精油乳液的儲(chǔ)藏。分析原因?yàn)榫驮诘蜏貤l件下易發(fā)生結(jié)晶，破壞乳液的界面膜，導(dǎo)致乳液顆粒的尺寸變大，均一性變差。此外，低溫環(huán)境會(huì)降低乳液體系的熱能，發(fā)生液滴少量聚集，亦不利于乳液的穩(wěn)定性[9]。

圖4 儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的肉桂精油乳液粒徑的影響Fig.4 Effect of storage time on particle size of emulsion with different cinnamon oil concentrations

2.5 肉桂精油乳液對(duì)大腸桿菌的抑制作用

為了探討肉桂精油乳液的抑菌效果，選擇上述制備的3種精油乳液T-0.5%、T-1.5%、T-2.5%，分別對(duì)應(yīng)乳液中肉桂精油的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.5%、2.5%，乳液液滴大小為50、150、280 nm（見(jiàn)圖1）。用無(wú)菌水將T-1.5%、T-2.5%分別稀釋3倍和5倍，以保證乳液中肉桂精油質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同，獨(dú)立探討乳液粒徑和抑菌情況的相關(guān)性。肉桂精油乳液對(duì)大腸桿菌的抑制情況，如圖5所示。未添加肉桂精油乳液的空白組中，吸光度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)一直增大。從生長(zhǎng)曲線來(lái)看，大腸桿菌生長(zhǎng)并未經(jīng)歷調(diào)整期，而直接呈指數(shù)式增長(zhǎng)，生長(zhǎng)良好。與空白組相比，乳液組的吸光度則持續(xù)下降，僅僅在培養(yǎng)初期0～1 h，乳液組的吸光度大于空白組，這是少量乳白色的乳液對(duì)光的散射所致。含有肉桂精油的乳液組均表現(xiàn)出良好的抑菌性能[10-11]，且T-1.5%組抑制效果最佳。由此可見(jiàn)，肉桂精油乳液粒徑的不同會(huì)對(duì)大腸桿菌的動(dòng)態(tài)抑菌曲線產(chǎn)生差異，在乳液粒徑為150 nm時(shí)抑菌效果達(dá)到最好。王婧等[12]發(fā)現(xiàn)采用吐溫80所制備的氯代肉桂醛納米乳，平均粒徑為15.88 nm，抑菌活性提高了50%～200%。

圖5 肉桂精油乳液對(duì)大腸桿菌的抑制效果Fig.5 Inhibitory effect of cinnamon oil emulsion on Escherichia coli

2.6 肉桂精油乳液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用

肉桂精油乳液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果見(jiàn)圖6所示?？瞻捉M中金黃色葡萄球菌經(jīng)過(guò)約15 h的調(diào)整期后，開(kāi)始迅速增長(zhǎng)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。而乳液組在整個(gè)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)（0～22 h），吸光度幾乎維持不變，且在5 h后，吸光度明顯低于空白組。表明金黃色葡萄球菌在肉桂精油乳液的作用下完全無(wú)法生長(zhǎng)。對(duì)比乳液組發(fā)現(xiàn)，T-1.5%的抑制作用最強(qiáng)，T-0.5%和T-2.5%的抑制作用相差不大。要達(dá)到對(duì)金黃色葡萄球菌最好的抑菌效果，乳液的粒徑為150 nm。對(duì)比圖5和圖6可得，肉桂精油乳液對(duì)大腸桿菌的抑制效果要優(yōu)于金黃色葡萄球菌。分析原因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁厚；大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，細(xì)胞壁薄。細(xì)胞壁組成結(jié)構(gòu)的不同引起了抑菌效果的差異[13]。肉桂精油可通過(guò)破壞微生物的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，損傷DNA而發(fā)揮抑菌作用[14-15]。

圖6 肉桂精油乳液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制情況Fig.6 Inhibition of Staphylococcus aureus by cinnamon oil emulsion

3 結(jié)語(yǔ)

作者首先通過(guò)改變?nèi)夤鹁偷奶砑恿浚ㄙ|(zhì)量分?jǐn)?shù)）0%～2.5%，利用司班20和吐溫80為復(fù)合乳化劑，制備出粒度范圍在50～280 nm的乳液。隨后探討了離心轉(zhuǎn)速、溫度、儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)肉桂精油乳液穩(wěn)定性的影響。乳液經(jīng)2 000～12 000 r/min離心處理，粒徑維持不變，穩(wěn)定性較好。在高溫條件下（60、80℃），乳液粒徑顯著增大，且出現(xiàn)分層現(xiàn)象，而在溫度低于40℃時(shí)，穩(wěn)定性較好。相比于4℃，乳液更適于在25℃條件下儲(chǔ)藏，儲(chǔ)藏10 d以內(nèi)，乳液的粒徑維持不變。最后，通過(guò)比濁法探討乳液的粒徑與抑菌性質(zhì)的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乳液粒徑為150 nm時(shí)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。本研究中通過(guò)乳化法提高了肉桂精油的穩(wěn)定性，并探討了乳液的抑菌性，可為后期在具體食品體系中的防腐殺菌應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。