不同粒徑的免疫磁珠對食源性致病菌捕獲效率的影響

李靜雯，杜美紅，楊 寅，陳 婷，陳爾凝，趙瑞雪

（北京市理化分析測試中心 北京市食品安全分析測試工程技術(shù)研究中心/北京市基因測序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京100089）

免疫磁珠（Immunomagnetic beads，IMBs）是 一類表面固定了特異性抗體的磁性顆粒，所以能夠特異性地捕獲目標(biāo)物并在一定磁場強度下分離目標(biāo)物[1]，由此形成的免疫磁分離技術(shù)已應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測[2]，體外診斷[3-4]和食品安全檢測[5-6]等諸多領(lǐng)域。在微生物檢測領(lǐng)域，由于傳統(tǒng)微生物病原體檢測前處理方法煩瑣耗時，世界上許多國家都采用免疫磁珠特異性捕獲作為一種有效的前處理方法，在大腸埃希氏菌O157：H7、賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲等微生物檢測標(biāo)準(zhǔn)中應(yīng)用[7-12]，使其檢測效率得到大幅提高。

微米級免疫磁珠（1～4.5μm）在食源性致病菌快速檢測樣品前處理中已經(jīng)被普遍采用[13-18]，以DynabeadsTM1μm、2.8μm免疫磁珠應(yīng)用最為廣泛。粒徑大小是影響免疫磁分離效率的重要因素之一，有研究發(fā)現(xiàn)大粒徑（2.8μm）磁珠的表面抗體的密度較高，所以相對于小粒徑（1μm）免疫磁珠對目標(biāo)菌的捕獲更加有效[19]。隨著市場的需求以及超順磁性顆粒制備技術(shù)的發(fā)展，亞微米級免疫磁珠（0.1、0.18、0.3、0.5μm等）也逐漸實現(xiàn)商品化應(yīng)用，目前我國自主研發(fā)的免疫磁珠粒徑以100 nm～1μm為主。由于比微米級免疫磁珠具有更大的比表面積優(yōu)勢，亞微米級免疫磁珠被更多地應(yīng)用于小分子靶標(biāo)的分離純化[20-24]。但是對于細(xì)菌、細(xì)胞等大分子目標(biāo)微生物的捕獲分離，在不同情況下，呈現(xiàn)了不同的捕獲率變化規(guī)律。Shan等[25]研究表明相同質(zhì)量下小粒徑（180 nm）免疫磁珠捕獲率高于大粒徑（350 nm）。但Chen等[13]研究顯示，經(jīng)過一段時間放置的小粒徑（100 nm）免疫磁珠捕獲率低于大粒徑（500 nm）免疫磁珠，并不符合比表面積大捕獲率高的簡單規(guī)律。而且免疫磁珠在食品中目標(biāo)菌的特異性捕獲過程中，需要面臨復(fù)雜的培養(yǎng)基或食品基質(zhì)，且存在大量的非致病雜菌的干擾。在這種情況下，微米級與亞微米級免疫磁珠各自的捕獲性能優(yōu)勢還沒有被充分研究證實。沙門氏菌是我國最常見的食源性致病菌之一[26]，是引起食品安全問題的首要原因。

作者以沙門氏菌免疫磁珠為對象，制備微米級和亞微級的免疫磁珠，比較免疫磁珠表面抗體偶聯(lián)量、對不同細(xì)菌濃度沙門氏菌目標(biāo)菌捕獲率、特異性、在不同基質(zhì)中的捕獲效率及磁回收率進行表征，以闡明免疫磁珠粒徑對食品樣品中微生物菌體捕獲效率的影響，旨在為免疫磁分離技術(shù)在食品中微生物快速檢測前處理中的應(yīng)用提供重要的科學(xué)依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 微生物培養(yǎng)

本研究采用的標(biāo)準(zhǔn)菌株：鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium，ATCC14028）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC25923），購自美國典型微生物菌種保藏中心。大腸桿菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7，NCTC12900），購買于廣東環(huán)凱微生物科技公司。首先室溫復(fù)蘇標(biāo)準(zhǔn)菌株，取適量菌懸液轉(zhuǎn)移至9 mL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，36℃靜置培養(yǎng)24 h。移取100μL培養(yǎng)物于滅菌離心管中，用緩沖液適當(dāng)梯度稀釋，然后在PCA瓊脂平板或HE瓊脂平板36℃培養(yǎng)24 h并計數(shù)。緩沖液是含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%氯化鈉和體積分?jǐn)?shù)0.05%Tween-20的0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液，pH 7.2左右。

1.2 不同粒徑免疫磁珠的制備

300 nm羧基磁珠：無錫百邁格生物科技有限公司產(chǎn)品；1μm羧基磁珠：賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品。分別取100μg 300 nm磁珠、100μg 1μm磁珠與1、1.5、2μg山羊抗沙門氏菌抗體制備免疫磁珠，制備方法參照前期研究發(fā)表論文[25]。通過激光粒度儀用動態(tài)光散射法表征2種免疫磁珠磁珠的粒度。

1.3 抗體偶聯(lián)量

免疫磁珠表面抗體偶聯(lián)量通過流式細(xì)胞儀表征，表征方法參照前期研究發(fā)表論文[27]。

1.4 捕獲率

制備細(xì)菌濃度為1×102～1×108CFU/mL的鼠傷寒沙門氏菌菌懸液，分別取50μg 300 nm免疫磁珠和1μm免疫磁珠加入1 mL上述菌懸液中，渦旋混勻，在混勻儀上旋轉(zhuǎn)30 min。在5 000 Gs的磁力架上磁分離10 min，取上清液用PCA瓊脂平板進行平板計數(shù)。用1 mL緩沖液將IMBs與沙門氏菌復(fù)合物重懸，同樣進行平板計數(shù)，每個實驗設(shè)置3個平行。免疫磁珠的捕獲率由以下公式（1）計算得到：

其中，CE為捕獲率（%）；Nu為上清液的菌落數(shù)（CFU）；Nb為重懸液的菌落數(shù)（CFU）。

利用掃描電子顯微鏡表征2種免疫磁珠的形貌特征，以及其與沙門氏菌的結(jié)合情況。

不同免疫捕獲體系體積：分別取300 nm和1μm沙門氏菌免疫磁珠各200μg，分別加入1、10 mL和25 mL PBST，同時投入1×103CFU鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌，溫和混勻，捕獲分離方法及捕獲效率計算同上。

不同免疫捕獲樣本體系：三元特品鮮牛奶全脂巴氏殺菌乳，購自北京某超市（經(jīng)平板培養(yǎng)，樣品沙門氏菌為陰性）。分別在1 mL緩沖液、1 mL與25 mL牛奶中加入1×103CFU的鼠傷寒沙門氏菌，然后分別投入200μg 300 nm或1μm免疫磁珠，免疫捕獲和磁分離過程同上，將上清液和重懸液在HE瓊脂平板上培養(yǎng)并計數(shù)，免疫磁珠的捕獲率計算方法同上。

1.5 特異性

制備細(xì)菌濃度為1×103CFU/mL金黃色葡萄球菌懸液和1×103CFU/mL大腸桿菌O157：H7菌懸液，分別與1×102CFU/mL鼠傷寒沙門氏菌菌懸液混合，向2種混合液中分別加入100μg 300 nm或1μm免疫磁珠，免疫捕獲和磁分離過程同上。在含有大腸桿菌O157：H7的實驗中，將上清液和重懸液分別在三糖鐵瓊脂和HE瓊脂中培養(yǎng)并計數(shù)，而金黃色葡萄球菌實驗中，需將培養(yǎng)基替換為BP瓊脂和HE瓊脂平板。分別計算免疫磁珠對這3種細(xì)菌的捕獲率。

1.6 磁回收率

分別取1 mL緩沖液或25 mL牛奶樣品，加入200μg 300 nm或1μm免疫磁珠，充分混勻。在強度為5 000 Gs的外加磁場下，每隔30 s棄去上清液，將免疫磁珠重懸。在可見光分光光度計410 nm和600 nm波長處分別檢測300 nm免疫磁珠和1 μm免疫磁珠重懸液隨時間變化的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以計算免疫磁珠的量，并按下列公式（2）計算磁回收率。

式中，I為磁回收率；I0為磁分離的免疫磁珠的物質(zhì)的量；I1為磁分離前免疫磁珠的物質(zhì)的量。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒徑對免疫磁珠抗體偶聯(lián)量的影響

磁珠表面抗體偶聯(lián)量的表征多采用BCA法或Bradford法，通過測定制備免疫磁珠后溶液中剩余抗體的濃度，以間接獲得磁珠表面抗體的偶聯(lián)量[28-29]。本研究中利用經(jīng)過FITC熒光標(biāo)記的二抗與免疫磁珠表面抗體特異性結(jié)合，采用流式細(xì)胞術(shù)表征免疫磁珠表面二抗FITC熒光強度的方法，直接反映磁珠表面抗體偶聯(lián)量。經(jīng)激光粒度儀檢測，300 nm和1μm磁珠經(jīng)抗體偶聯(lián)后的平均粒徑分別（310±137）、（1 103±175）nm。當(dāng)不同質(zhì)量濃度抗體參與免疫磁珠的制備，抗體質(zhì)量濃度越高共價偶聯(lián)于磁珠表面的抗體也逐漸增多（見圖1），說明磁珠抗體質(zhì)量比為100∶2時，并未達到磁珠的最大抗體偶聯(lián)量，此時偶聯(lián)于300 nm磁珠上的抗體量比1μm磁珠多31%。因為亞微米級免疫磁珠粒徑較小，比微米級免疫磁珠有較大的比表面積，所以能偶聯(lián)較多的抗體，也意味著有更大的概率與目標(biāo)菌表面抗原結(jié)合。檢測這2種粒徑的免疫磁珠對1×102～1×108CFU/mL沙門氏菌的捕獲情況也驗證了上述推測，300 nm免疫磁珠對各細(xì)菌濃度沙門氏菌的捕獲率都較高（見圖2）。然而，由于磁珠表面固定了大量抗體，與非目標(biāo)菌可能發(fā)生交叉反應(yīng)，而且免疫磁珠自身帶有一定量的靜電荷，能物理吸附少量細(xì)菌菌體，因此免疫磁珠對非目標(biāo)菌也能有一定的捕獲率。研究粒徑對免疫磁珠特異性以及雜菌干擾下捕獲效率的影響，結(jié)果顯示，2種免疫磁珠對大腸桿菌O157：H7的捕獲率均小于8%，對免疫磁珠捕獲沙門氏菌的效率影響不大，所以依然是小粒徑免疫磁珠擁有較高捕獲率。但由于金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁中的蛋白A能與抗體IgG的Fc片段結(jié)合[30]，導(dǎo)致能特異性結(jié)合目標(biāo)菌的免疫磁珠相對減少，所以金黃色葡萄球菌的存在使免疫磁珠對沙門氏菌的捕獲率降低了。因為相同質(zhì)量的亞微米級免疫磁珠比微米級免疫磁珠偶聯(lián)的抗體更多，顆粒數(shù)更多，所以對目標(biāo)菌的捕獲率受雜菌的影響較?。?00 nm：66%，1μm：29%），但其對雜菌的捕獲率也相對較高（見圖3）。此外，由于300 nm免疫磁珠粒徑小，在與大體積目標(biāo)菌（＞1μm）免疫反應(yīng)過程中具有一定的空間優(yōu)勢與靈活性，通過掃描電子顯微鏡對300 nm、1μm免疫磁珠形態(tài)特征及其與沙門氏菌免疫捕獲反應(yīng)情況進行表征（見圖4）可以看出?？傊?，粒徑較小的亞微米免疫磁珠因抗體偶聯(lián)量多，有助于目標(biāo)菌的特異性捕獲。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)表征300 nm、1μm免疫磁珠表面抗體Fig.1 Characterize of antibody on 300 nm，1μm IMBs by flow cytometry

圖2 300 nm、1μm免疫磁珠在1 mL PBST中對鼠傷寒沙門氏菌的捕獲率Fig.2 Capturing efficiency of 300 nm and 1μm IMBs for Salmonella Typhimurium in 1 mL PBST

2.2 粒徑對免疫磁珠磁回收性能的影響

采用分光光度計測量300 nm免疫磁珠和1μm免疫磁珠分別在410 nm與600 nm波長處的吸光度值定量免疫磁珠的濃度，以計算出在PBST溶液和牛奶中經(jīng)過不同時間磁分離后的免疫磁珠的回收率。結(jié)果顯示：在1 mL緩沖液中，磁分離1.5 min后，300 nm和1μm免疫磁珠磁回收率都達到95%以上（見圖5）。而大體積、復(fù)雜基質(zhì)延遲了免疫磁珠的磁回收時間，且2種免疫磁珠的磁回收率都降低到64%以下，1μm免疫磁珠的磁回收率要高于300 nm免疫磁珠（300 nm：52%，1μm：64%，見圖6）。因為免疫磁珠粒徑越大體積越大，磁含量也越多。牛奶有一定黏度，且含有大量的脂肪[31]，影響了免疫磁珠在磁場中的遷移，尤其是磁含量低的亞微米級免疫磁珠不能進行有效的磁分離。

圖3 300 nm、1μm免疫磁珠的特異性Fig.3 Specificity of 300 nm IMBs and 1μm IMBs

圖4 免疫磁珠與目標(biāo)菌結(jié)合狀態(tài)掃描電鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopy of IMBs with Salmonella Typhimurium

圖5 300 nm和1μm免疫磁珠在1 mL PBST中磁回收率Fig.5 Recovery rate of 300 nm and 1μm IMBs in 1 mL PBST

圖6 300 nm和1μm免疫磁珠在25 mL牛奶基質(zhì)中的磁回收率Fig.6 Recovery rate of 300 nm and 1μm IMBs in 25 mL milk

2.3 粒徑對免疫磁珠在不同體系中捕獲效率的影響

基于國標(biāo)方法中捕獲體積（1 mL）[11]、采樣體積（25 mL）[32]的規(guī)定，并參考以往研究[33]，本研究設(shè)計了3個免疫捕獲體系體積（1、10、25 mL），以考察粒徑對免疫磁珠在不同體積液體中的捕獲率（見圖7）。結(jié)果顯示，300 nm和1μm免疫磁珠隨著免疫捕獲體積的增大，捕獲率均呈現(xiàn)下降趨勢，其中，1 μm免疫磁珠下降趨勢更顯著。在無雜質(zhì)背景溶液（PBST）中，捕獲體積逐漸增大，免疫磁珠與目標(biāo)菌的有效碰撞次數(shù)減少是捕獲率下降的主要原因，由于相同質(zhì)量免疫磁珠粒徑越小，個數(shù)越多，偶聯(lián)抗體自由度越大，相對在較大捕獲體積情況下表現(xiàn)出較高的目標(biāo)菌捕獲率[34-35]。

圖7 300 nm和1μm免疫磁珠在不同體積PBST中的捕獲效率Fig.7 Capture efficiency of 300 nm and 1μm IMBs in PBST with different volumes

考察了2種免疫磁珠在牛奶基質(zhì)中的捕獲率，結(jié)果表明，2種免疫磁珠的目標(biāo)菌捕獲率均降低到50%以下，1 mL牛奶中300 nm免疫磁珠捕獲率較高，而25 mL牛奶中，1μm免疫磁珠捕獲率較高（見圖8）。牛奶中含有豐富的蛋白質(zhì)成分[36-37]，在一定程度上會干擾免疫磁珠表面抗體的特異性免疫反應(yīng)[31]。微米級免疫磁珠表現(xiàn)出了較好的磁回收率，所以有較好的免疫捕獲表現(xiàn)。因此，復(fù)雜基質(zhì)，特別是有一定黏度的大體積基質(zhì)，應(yīng)該選擇微米級免疫磁珠。

圖8 300 nm和1μm免疫磁珠在不同捕獲體系中的捕獲效率Fig.8 Capture efficiency of 300 nm and 1μm IMBs in different liquids

3 結(jié)語

本文中以沙門氏菌為代表，研究免疫磁珠不同粒徑對食源性致病菌捕獲效率的影響。免疫磁珠由一定量特異性抗體通過化學(xué)偶聯(lián)在超順磁性顆粒表面而形成，其表現(xiàn)出的抗原結(jié)合能力和磁響應(yīng)性能決定了免疫磁珠的捕獲率。因此，作者在采用相同的抗體包被的前提下，以抗體偶聯(lián)量及磁回收率為主要考察因素，研究在不同基質(zhì)、不同體積捕獲體系中微米級和亞微米級免疫磁珠的捕獲效率。采用流式細(xì)胞儀直接測定免疫磁珠表面偶聯(lián)抗體的情況，不僅避免了間接檢測方法中偶聯(lián)液和磁珠活化液的干擾，還能消除因抗體種類不同而產(chǎn)生的檢測誤差，方便對不同抗體免疫磁珠的比較，也可以直觀地展示免疫磁珠抗體偶聯(lián)量的分布情況。本文中，采用分光光度計測量免疫磁珠的濃度進而計算磁回收率，該方法簡單快速也較為準(zhǔn)確。由于免疫磁珠的比表面積與粒徑成反比，所以亞微米免疫磁珠能固定較多的抗體，而且在簡單基質(zhì)（如緩沖液）中磁回收率也較高，因此對目標(biāo)菌的免疫捕獲率更高，但同時對能產(chǎn)生交叉反應(yīng)的雜菌的捕獲率也更高。然而，在基質(zhì)復(fù)雜的牛奶樣品中，受樣品中各成分的干擾，免疫磁珠在磁場中遷移的阻力增加，其中，微米級免疫磁珠中磁含量相對較高，磁回收率相對較高，從而表現(xiàn)出高于亞微米級免疫磁珠的捕獲率。在實際樣本中進行食源性致病菌的免疫磁分離時，簡單基質(zhì)可以選擇亞微米級免疫磁珠，有一定黏度的復(fù)雜基質(zhì)，特別是大體積，應(yīng)選擇微米級免疫磁珠。作者著重研究了不同粒徑的免疫磁珠對捕獲效率的影響，此外，磁珠的帶電性、抗體的特異性等因素同樣對捕獲效率產(chǎn)生重要影響，我們會在今后逐步開展相關(guān)研究。