慢阻肺的血清組織蛋白酶S 檢測及其臨床意義

陳嘉俊，佘秋民，趙冰，王希上

（深圳市寶安區(qū)松崗人民醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518105）

慢性阻塞性肺部疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）簡稱慢阻肺，是一組以持續(xù)氣流受限為主要特征的、能夠預(yù)防和醫(yī)治的肺部疾病，近年來研究證明慢阻肺已成為與高血壓和糖尿病“旗鼓相當(dāng)”的慢性疾病，包括慢阻肺在內(nèi)的慢性呼吸道疾病已成為繼心血管疾病、糖尿病之后的第三大死亡原因[1-3]。

肺功能檢查是確診COPD 及評估病情嚴重程度最重要的檢查，還可用于治療效果的評價，但肺功能檢查的效果與臨床醫(yī)生是否經(jīng)驗豐富、患者是否積極配合等有很大關(guān)系，目前臨床上對COPD 進行診斷、分級、評估和預(yù)后存在明顯的局限性，因此從血液中檢測COPD 特征性生物標(biāo)記物正逐步成為研究熱點[4]。 有研究表明，血清組織蛋白酶S（cat S）的表達水平可能與COPD 的發(fā)病和病情嚴重程度相關(guān)，血清cat S 可加快COPD 肺氣腫的產(chǎn)生與小氣道重塑，并且參與COPD 的發(fā)生發(fā)展[5]。

本研究旨在通過探討血清cat S 含量與COPD發(fā)病及嚴重程度的關(guān)系，評價其作為實驗室檢測指標(biāo)在COPD 輔助診斷和臨床診治中的應(yīng)用價值。報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 COPD 組 選擇 2017 年 1 月到 2018 年 9 月在我院呼吸內(nèi)科門診部隨診的COPD 病患73 例（男 45 例，女 28 例），年齡在 55～84 歲；平均年齡為70±7.6 歲，滿足中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013 年修訂版)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)：除其他疾病外，在吸入支氣管擴張劑1s 用力呼氣容積/用力肺活量%（FEV1/FVC）＜70%時，表明持續(xù)氣流受限。 再根據(jù)氣流受限的嚴重程度，將COPD 組分為Ⅰ～Ⅳ級，Ⅰ級有16 例，均為輕度慢阻肺， 數(shù)據(jù)顯示FEV1/FVC＜70%但FEV1≥80%預(yù)計值；Ⅱ級有26 例，均為中度慢阻肺，數(shù)據(jù)顯示50%≤FEV1＜80%預(yù)計值；Ⅲ級有24 例，均為重度慢阻肺，數(shù)據(jù)顯示30%≤FEV1＜50%預(yù)計值；Ⅳ級有7 例，均為極重度慢阻肺，數(shù)據(jù)顯示FEV1＜30%預(yù)計值，時常伴隨慢性呼吸衰竭癥狀。

1.1.2 對照組 設(shè)置 54 例，男 28 例，女 26 例，年齡在 51～80 歲，平均年齡為 65±10.2 歲，而且都為同一時期本院健康檢查中確定的基本健康者。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集2 組患者臨床一般資料，其中包含年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）、是否吸煙等資料。

1.2.2 血清cat S BA-ELISA 檢測方法的建立 用cat S 單克隆抗體作為包被抗體，生物素標(biāo)記的cat S 多克隆抗體作為結(jié)合抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈親合素(SA-HRP)為酶標(biāo)記物，TMB 作為底物，重組人cat S 作為校準(zhǔn)品，經(jīng)工藝和反應(yīng)條件優(yōu)化，建立血清cat S BA-ELISA 法。 cat S 單克隆抗體、兔抗 cat S 多克隆抗體、SA-HRP、 重組人 cat S、TMB 顯色底物均由深圳市安群生物工程有限公司供應(yīng)[15]。

1.2.3 臨床樣本測定 COPD 組和對照組空腹采集外周靜脈血3ml，分離血清，置-20℃凍存。 用上述方法檢測cat S 濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 我們采用SPSS25 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。 計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，而計數(shù)資料使用數(shù)量或百分比表示。 只有兩個組合之間相比較就使用獨立樣本t 檢驗，若是多個組合間比較使用方差分析； 采用多重線性回歸分析評估血清 cat S 與 COPD 關(guān)系； 用受試者工作特征（ROC）曲線判斷血清中cat S 水平對COPD 診斷價值。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組一般資料比較 COPD 組和對照組進行單因素分析，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的因素有年齡和是否吸煙， 兩組間的性別與BMI 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表1。

表1 研究對象一般資料

2.2 2 組血清cat S 水平比較 COPD 組血清cat S含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

表2 COPD 組與對照組血清中cat S 水平比較

2.3 cat S 影響因素的多重線性回歸分析 以血清中cat S 水平作為因變量，COPD 分組、受試者的性別、年齡、是否吸煙作為自變量，采用多重線性回歸分析，經(jīng)逐步后退分析，對性別、年齡、吸煙因素進行校正后，COPD 患者與對照組的血清中cat S水平有顯著差異（P＜0.01）。 見表3。

表3 cat S 影響因素的多重線性回歸分析

2.3 不同嚴重程度COPD 患者血清cat S 水平比較四組間血清cat S 水平存在顯著差異 （F=22.69，P＜0.01），其與 COPD 嚴重程度相關(guān)；cat S 水平：Ⅳ級＞Ⅲ級＞Ⅱ級＞Ⅰ級（P＜0.01），表明血清 cat S 水平與COPD 病情程度成正比。 見表4。

表4 不同COPD 分級患者血清中cat S 水平比較

2.4 ROC 曲線分析 血清 cat S 診斷 COPD 的ROC 曲線。曲線下面積(AUC)為0.905。當(dāng)切點設(shè)定為≥10.53μg/L，靈敏度76.9%，特異性92.6%。見圖1。

圖1 cat S 的 ROC 曲線

3 討論

慢阻肺（COPD）是呼吸系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，近年來的發(fā)病率呈上升趨勢[6]，慢阻肺的診斷多根據(jù)臨床表現(xiàn)，缺乏量化指標(biāo)，血清生物標(biāo)志物是一種定量指標(biāo)，可靠的血清標(biāo)志物有助于慢阻肺的診斷，指導(dǎo)治療和預(yù)后[7]。 目前，臨床上也對多種血清學(xué)指標(biāo)和COPD 的相關(guān)性進行了研究，馬原、田玉恒考察了慢阻肺患者 HDAC2、IL-8、TNF-α水平變化[8]；范維、袁本林等探討了血清PCT、UA、CRP、WBC 和 Glu 等指標(biāo)的濃度變化對 COPD 急性加重期的臨床意義[9，10]；劉芳[11]研究了血清 hs-CRP、IL-6、PCT 及脂聯(lián)素聯(lián)檢在 COPD 中的應(yīng)用價值；徐輝等[12]的研究也揭示了組織蛋白酶S 表達水平可能與COPD 病情有關(guān)。組織蛋白酶S（Cat S）是半胱氨酸蛋白酶的重要一員，是單鏈蛋白，由225個氨基酸組成，其相對分子量為24.8KDa，與多種疾病的產(chǎn)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)[13]。 本研究采用生物素-親和素系統(tǒng)建立了cat S BA-ELISA 檢測方法，包被抗體采用cat S 單克隆抗體，結(jié)合抗體為生物素標(biāo)記的cat S 多克隆抗體，經(jīng)方法驗證，靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度等指標(biāo)均達到臨床應(yīng)用的要求。 對比S.N.Kehlet[14]等的方法，本研究建立的BA-ELISA 法借助生物素-親和素放大效應(yīng)[15]在常規(guī)ELISA 技術(shù)的基礎(chǔ)上增加了一級放大，檢測靈敏度更高。

本研究對73 例COPD 患者和54 例對照組的血清樣本進行了檢測，COPD 組血清 cat S 為18.02±8.73μg/L，健康對照組 7.83±2.20μg/L，顯示COPD 患者血清中cat S 水平與正常對照組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-8.36，P＜0.01）；對 cat S 影響因素進行多重線性回歸分析，將COPD 分組（COPD組、對照組）、年齡、性別（男、女）、吸煙因素（吸煙、不吸煙） 等變量均納入初始的多變量線性回歸模型， 只有在逐步后退分析中P＜0.1 的變量被保留，由此產(chǎn)生的模型最終只保留了與血清cat S 相關(guān)的兩個變量COPD 分組和吸煙因素， 而且在對年齡、性別（男、女）、吸煙因素（吸煙、不吸煙）等變量進行校正后，COPD 組的血清中cat S 水平仍較對照組明顯升高（標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù) B=0.449，P＜0.01），且吸煙者的cat S 水平也較不吸煙者高（標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)B=0.409，P＜0.01）；將Ⅰ～Ⅳ級不同程度 COPD 患者血清cat S 水平進行比較，研究顯示Ⅰ～Ⅳ組不同嚴重程度的COPD 患者cat S 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=22.69，P＜0.01）， 而隨著 COPD 病情加重，cat S水平也逐漸上升， 顯示cat S 水平與COPD 病情嚴重程度顯著正相關(guān)，這與李耕誼等[16]研究結(jié)果一致；經(jīng) ROC 曲線分析，AUC 為 0.905，以約登指數(shù)最大為原則，最佳臨界值 Cat S＞10.53μg/L 時，靈敏度為76.9%，特異度為92.6%。上述結(jié)果說明血清組織蛋白酶S 項目可作為實驗室對臨床檢測慢阻肺的一項有效指標(biāo)。

綜上所述，COPD 患者血清cat S 濃度具有異常升高表現(xiàn)，且病情程度越重，患者cat S 水平越高，可為COPD 患者臨床輔助診斷及療效監(jiān)測（評估）提供重要依據(jù)。