1，25(OH)2D3/VDR 對濕疹患兒 miRNA155/SOCS1通路的調(diào)節(jié)作用

江永青，汪紅，胡穎，胡志堅(jiān)，詹忠明，何媛

（九江學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科， 江西 九江 332000）

濕疹，通常被稱為“特應(yīng)性皮炎”，是一種表皮及真皮淺層的慢性炎癥，其在兒童中發(fā)病率遠(yuǎn)高于成人，發(fā)病高峰期發(fā)病率可達(dá)到28.7%[1]。濕疹臨床可表現(xiàn)為慢性反復(fù)發(fā)作的皮膚瘙癢、干燥和疼痛，生活質(zhì)量下降，甚至導(dǎo)致抑郁癥狀、社會隔離以及自我認(rèn)同感下降等精神心理疾患，同時(shí)也為社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為與自身免疫功能和皮膚屏障功能有關(guān)。 近期研究顯示維生素D 經(jīng)代謝形成的活性產(chǎn)物--維生素D3(，1，25-dihydroxyvitamin D3， 1，25(OH)2D3）與多種免疫相關(guān)性疾病有關(guān)，如哮喘、蕁麻疹、食物過敏等[2，3]。 而只有表達(dá)維生素 D 受體(vitamin D receptor，VDR）的組織器官才能有效發(fā)揮活性維生素D的作用。 此外， 1，25 (OH)2D3/VDR 是否通過 miRNA155/SOCS1 通路參與濕疹的發(fā)生， 尚不清楚。為此本實(shí)驗(yàn)檢測濕疹患者 1，25 (OH)2D3、VDR、 miRNA155 及 SOCS1 表達(dá)量的變化，探討 1，25(OH)2D3/VDR 對濕疹患兒miRNA155/SOCS1 通路的調(diào)節(jié)作用，為濕疹的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 選取 2016 年 1 月-2018 年 7 月在九江學(xué)院附屬醫(yī)院就醫(yī)的濕疹患兒108 例，男性57 例，女性 51 例， 平均年齡 5.4±3.5 歲。 正常對照組 77例，均來自外科手術(shù)患兒，皮膚組織無病變，其中男 42 例，女 35 例，平均年齡 6.2±4.1 歲，其性別、年齡與患者相匹配。 濕疹患者的診斷及分期均符合趙辨主編的《中國臨床皮膚病學(xué)》第四版[4]。 入選實(shí)驗(yàn)對象標(biāo)準(zhǔn)：⑴臨床醫(yī)生確診為濕疹的患者；⑵排除嚴(yán)重心肺功能不全和肝腎功能不全者； ⑶2周內(nèi)未局部外用皮質(zhì)類固醇激素、維生素D3 衍生物、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑及免疫抑制劑;⑷近1 個(gè)月未系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、補(bǔ)骨脂素、阿維A 等系統(tǒng)治療及日光浴、紫外線治療；⑸未合并皮膚真菌、病毒等感染類疾病或其他相關(guān)皮膚病患者;⑹無藥物過敏史；⑺符合倫理道德，遵循知情同意原則。

1.2 方法

取患者與健康對照組靜脈血5ml (促凝管)，采用羅氏Cobas 6000 自動生化免疫分析儀， 用電化學(xué)發(fā)光法檢測患者血清1，25(OH)2D3含量。 試劑盒由羅氏診斷公司提供。

取患者與健康對照組外周靜脈血50μl (EDTA抗凝)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測患者T 細(xì)胞百分比。 6 C-TBNK(美國 BD 公司， 批號:90646)避光孵育 20 min， 用含 0.5%BSA 的 PBS 洗 2 遍， 流式細(xì) 胞 儀(美國， BD FACSCanto TMII) 檢測。

取患者皮損處組織與對照組皮膚組織， 采用Trizol 法提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。 以 cDNA 為模板、 以 β-actin 為內(nèi)參基因進(jìn)行 RT-PCR反應(yīng)。 采用實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀(美國，A&B 7500 Real Time PCR System)檢測 VDR、miRNA155、SOCS1 及β-actin 表達(dá)。 引物均通過 GenBank 檢索得到：VDR F-5' ATGCCATCTGCATCGTCTC 3'，R-5'GCACCGCACAGGCTGTCCTA 3'；miRNA155 F-5'TAATGCTAATCGTGATAGGG3'，R -5'TTTGGCACTAGCACATT3'；SOCS1 F-5′ CTTCTGTAGGATGGTAGCACAC -3'，R -5′ AGGAAGAGGAGGAAGGTTCT-3'；β-actin F-5’ TGGCACCCAGCACAATGAA 3’，R-5’ CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA 3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理， 運(yùn)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s 表示，進(jìn)行方差分析， 計(jì)量資料比較方法采用SN—K 法兩兩比較。 RT-PCR 數(shù)據(jù)采用 2-△△ct法處理，將各基因的Ct 值減去β -actin 的平均Ct 值作為△Ct 值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 濕疹患者與健康對照組血清1，25(OH)2D3濃度的變化 濕疹患者血清 1，25 (OH)2D3含量 29.25±11.03 nmol/L， 健康對照組為 55.49±21.66 nmol/L，濕疹患兒明顯低于健康兒童（P＜0.05）。

2.2 濕疹患兒淋巴細(xì)胞亞群的分析 結(jié)果顯示，濕疹患兒 T 細(xì)胞亞群（CD3+，%）及 CD4+的 T 淋巴細(xì)胞亞群（CD3+CD4+，%）明顯高于對照組，CD8+的 T淋巴細(xì)胞亞群（CD3+CD8+，%）明顯低于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 各組T 淋巴細(xì)胞亞群的比較（±s）

表1 各組T 淋巴細(xì)胞亞群的比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05

CD3+(%)對照組濕疹患兒組64.47±17.23 68.65±16.74*CD3+CD4+(%) CD3+CD8+(%)33.25±11.95 38.83±10.82*29.01±7.93 25.68±6.81*CD4+/CD8+1.24±0.49 1.50±0.60*

2.3 濕疹患者 VDR 、miRNA155、SOCS1 基因的表達(dá) 與對照組相比，濕疹患者皮損處VDR 、SOCS1的表達(dá)明顯下降，miRNA155 的表達(dá)明顯上升 （P＜0.05），見表2。

表2 濕疹組和對照組 VDR 、miRNA155、SOCS1 表達(dá)水平比較（±s）

表2 濕疹組和對照組 VDR 、miRNA155、SOCS1 表達(dá)水平比較（±s）

注：與對照組比較 ， *P＜0.05

VDR對照組濕疹患兒組3.62±1.68 1.74±0.92*miRNA155 SOCS1 2.06±0.84 5.41±3.23*3.13± 1.70*1.78±1.02

2.4 濕疹患者血清1，25(OH)2D3濃度與各指標(biāo)的相關(guān)性 濕疹患者血清 1，25 (OH)2D3濃度與 miRNA155 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）， 與 VDR、SOCS1 表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05)，見表3。

表3 濕疹患者血清1，25(OH)2D3 濃度與各指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

濕疹造成濕疹樣皮損，產(chǎn)生劇烈瘙癢，患者焦慮，生活質(zhì)量下降。 濕疹發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為其病因可能與多種內(nèi)外因素相關(guān)，如自身免疫系統(tǒng)功能失調(diào)、慢性皮膚感染、代謝紊亂、化學(xué)物質(zhì)等[5]。 中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、免疫球蛋白和補(bǔ)體都是濕疹重要參與者[6]。

1，25 (OH)2D3屬脂溶性類固醇衍生物，是維生素D 家族最重要的成員。 維生素D 可抑制固有免疫及炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)皮膚屏障功能，這在濕疹的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要。 維生素D 可以通過多種途徑影響免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。 在針對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的實(shí)驗(yàn)中，研究人員發(fā)現(xiàn)1，25(OH)2D3可通過調(diào)節(jié)Th1和 Th17 的平衡，起到免疫調(diào)節(jié)作用[7]。 此外，研究人員在自身免疫性甲狀腺疾病的研究中發(fā)現(xiàn)， 抗甲狀腺過氧化物酶抗體與血清25-羥基維生素D 之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。 TPOAb 陽性在維生素D 缺乏者中更為普遍[8]。 活性維生素D 生物活性的表達(dá)依賴于維生素D 受體的存在。 研究人員在小鼠濕疹模型的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低鈣狀態(tài)VDR 未被激活，使得濕疹的癥狀明顯加重。在經(jīng)過VDR 激動劑治療的小鼠皮膚中，有Foxp3 表達(dá)的調(diào)節(jié)T 細(xì)胞明顯增多，且皮膚屏障基因和抗菌肽基因明顯增強(qiáng)[9]。

在皮膚屏障功能方面，維生素D 及其受體可調(diào)節(jié)基底層的增殖，調(diào)控棘層和顆粒層蛋白，并調(diào)控角質(zhì)層脂質(zhì)的合成[10]。 因此，維生素D 可通過改變表皮屏障功能、免疫失調(diào)和細(xì)菌防御不足來調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)。 微小 RNA(microRNA，miRNA)是一類豐富的非編碼RNA，由于其調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力，在許多生物過程中起著重要的作用。 多種miRNA 參與調(diào)節(jié)免疫、自身免疫和預(yù)防[9]。 其中，miRNA155 是現(xiàn)有研究中發(fā)現(xiàn)的免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)基因。 許多免疫細(xì)胞的刺激可以引起miRNA155 的顯著升高[11，12]。 研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘變化期間，可能通過 miRNA133 和miRNA155 的調(diào)節(jié)，間充質(zhì)干細(xì)胞，而非條件培養(yǎng)基在減少病理變化中的潛在作用[13]。miRNA155 可上調(diào) T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞的活性[14，15]。 據(jù)報(bào)道，缺乏miRNA155 的B 細(xì)胞反性應(yīng)降低，不能產(chǎn)生高親和力的抗體免疫球蛋白（Ig）[16]。 SOCS1 是重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的增殖及發(fā)揮其功能中起作用，這可阻止自身活性T 細(xì)胞的增殖及效應(yīng)器功能，從而維持自身抗原對外周的耐受性[17]。Treg 細(xì)胞中 CD4、CD25 和 Foxp3 的表達(dá)為陽性，這是它們發(fā)育和發(fā)揮功能所必需的。 SOCS1 可阻止Treg 產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子，在沒有SOCS1 的情況下，Tregs 失去Foxp3 的表達(dá)，并成為致病性T 細(xì)胞[18]。 此外，microRNA-221 通過靶向 SOCS1/NF-κB途徑來促進(jìn)I 型干擾素的產(chǎn)生，從而限制了人類巨細(xì)胞病毒（HCMV）的復(fù)制[19]。 在小鼠的肺癌模型中研究者證實(shí)，MicroRNA-30a 可通過SOCS1 控制誘導(dǎo)型 CD4+Treg 的不穩(wěn)定性[18]。 而 1，25(OH)2D3可通過 miRNA155-SOCS1 通路負(fù)反饋調(diào)節(jié) TLR 信號，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。 2017 年Kempinska-Podhorodecka A 等[20]在對免疫相關(guān)性疾病原發(fā)性膽汁性膽管炎， 降低VDR 表達(dá)可通過miRNA155-SOCS1 通路影響機(jī)體免疫功能。

本實(shí)驗(yàn)通過檢測濕疹及對照組兒童的相應(yīng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，濕疹患兒 1， 25(OH)2D3、VDR 明顯下降，而miR-155 明顯上升，同時(shí)伴隨 SOCS1 的下降。 提示1，25 (OH)2D3、VDR 可 能 通 過 靶 向 miRNA155-SOCS1 限制炎癥反應(yīng)。 當(dāng) 1，25(OH)2D3/VDR 不足，將導(dǎo)致其誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)受損，誘發(fā)免疫炎癥的發(fā)生。 1，25 (OH)2D3/VDR 的下降， 負(fù)反饋調(diào)節(jié) miR-155，使其表達(dá)上升，而過度表達(dá)的 miR-155 造成對 SOCS1 的抑制，使SOCS1 下降。