輕型顱腦損傷患者血清miR-16 和miR-92a 的表達(dá)變化與預(yù)后的相關(guān)性研究

潘長福 ，段景麗 ，何燕 ，翁中海 ，余兆祥

（景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院1.神經(jīng)外科；2.急診科，江西 景德鎮(zhèn) 333000）

創(chuàng)傷性顱腦損傷（Traumatic brain injury， TBI）是一類嚴(yán)重危害人類生命和健康的疾病。 據(jù)估計(jì)，我國腦外傷患者發(fā)病率為每年150～120/10 萬人[1]，其中輕型顱腦損 （mild traumatic brain injury， mild TBI）占比高達(dá) 75～90%[2]。 對(duì)于絕大多數(shù)輕型顱腦損傷患者而言，傷后無需特殊治療即可在數(shù)周至數(shù)月內(nèi)恢復(fù)正常。 但約20%患者仍遺留有腦創(chuàng)傷后綜合征，如頭痛、頭昏、失眠、記憶力下降、焦慮、抑郁等，嚴(yán)重影響其正常工作和學(xué)習(xí)[3，4]。 盡管人們對(duì)輕型顱腦損傷越來越重視，但對(duì)其診斷與預(yù)后判斷仍缺乏有效手段。 在過去的幾十年中，許多蛋白分子被認(rèn)為是有價(jià)值的顱腦損傷生物學(xué)標(biāo)志物，如GFAP、NSE、UCH-L1、MBP 和S100B 等[5，6]。 然而，大部分蛋白分子對(duì)影像學(xué)正常的輕型顱腦損傷患者敏感性很低，迄今為止，還沒有任何蛋白類標(biāo)志物運(yùn)用于臨床[7]。 MicroRNAs (miRNA)為內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與調(diào)控多種生物學(xué)過程[8-11]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA 在腦外傷后血清內(nèi)表達(dá)水平發(fā)生明顯變化，具有潛在的生物學(xué)診斷價(jià)值[7，9，12]。 本文擬檢測(cè)輕型顱腦損傷患者血清miR-16 和miR-92a 的表達(dá)變化，探討其對(duì)輕型顱腦損傷患者診斷與預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 資料收集 依據(jù)格拉斯哥評(píng)分 （Glasgow Coma Scale，GCS）系統(tǒng)，可以將創(chuàng)傷性顱腦損傷分為輕型GCS13～15 分、中型 GCS9～12 分和重型 GCS3～8 分[13]。 本研究收集 2018 年 6 月至 2018 年 12 月于景德鎮(zhèn)市第一人民急診外科和神經(jīng)外科救治的輕型顱腦損傷患者GCS 評(píng)分13～15 分。病例判斷標(biāo)準(zhǔn)：⑴患者年齡＞18 歲，＜75 歲， 無合并其它系統(tǒng)損傷及既往無心、腦系統(tǒng)重大疾病史；⑵頭部外傷12h以內(nèi)；⑶入院時(shí)GCS 評(píng)分13～15 分，且入院后GCS評(píng)分無降低；⑷排除受傷前患者有飲酒、使用毒麻和鎮(zhèn)靜藥物、精神、智力異常；⑸入院前未使用任何藥物治療者。 本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得患者及家屬知情同意。

1.2 分組 入院時(shí)所有患者均于急診使用荷蘭飛利浦64 排128 層螺旋CT 進(jìn)行頭顱掃描。 將顱骨及顱內(nèi)未見明顯外傷性改變患者視為顱腦CT 陰性48 例。 發(fā)現(xiàn)以下任何情況均視為顱腦CT 結(jié)果陽性：單純顱骨骨折8 例、顱骨骨折合并硬膜外血腫6 例、硬膜下血腫6 例、蛛網(wǎng)膜下腔出血8 例、腦挫裂傷4 例。共收集患者80 例，將32 例顱腦CT檢查結(jié)果陽性者列為A 組，48 例顱腦CT 檢測(cè)結(jié)果陰性者列為B 組。 將同期本院體檢健康成人40例列為對(duì)照組。 三組人員性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

1.3 標(biāo)本采集 腦外傷患者入院后未行藥物治療前留取靜脈血5 ml，健康體檢者于空腹時(shí)留取靜脈血，離心后血清置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 miR-16 和 miR-92a 檢測(cè) 采用 trizol 試劑盒提取血清內(nèi)總RNA；以PrimeScript TM RT reagent kit 逆轉(zhuǎn)錄 RNA 為 cDNA，反應(yīng)條件：42℃ 15min，85℃ 5s。 采用 miScript Primer Assays、miScript SYBR Green PCR Kit 反應(yīng)體系，使用ABI 7500 real-time PCR system 中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。 反應(yīng)條件：95°C，10min；95°C，15s，60°C，60s，40 個(gè)循環(huán)。 采用 U6 作為內(nèi)參，健康體檢者血清為對(duì)照，用2-ΔΔCt表示基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 GOSE 評(píng)分 所有患者于傷后6 個(gè)月進(jìn)行GOS E 評(píng)分。 GOSE 評(píng)分分為 8 個(gè)等級(jí)：8 為恢復(fù)良好；7為恢復(fù)良好， 伴有輕微的身體和智力缺陷；6 為中等殘疾， 恢復(fù)以前的工作但需要一些調(diào)整；5 為中等殘疾，低水平的工作；4 為嚴(yán)重殘疾，依賴他人，可以做一些日?；顒?dòng)；3 為嚴(yán)重殘疾， 日?；顒?dòng)完全依賴他人；2 為植物狀態(tài)；1 為死亡。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。 多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組均數(shù)間比較采用小樣本t 檢驗(yàn)。 采用Spearman 分析血清miR-16、miR-92a 表達(dá)量和 GOS-E 評(píng)分相關(guān)性。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較 腦外傷A 組、B 組和對(duì)照組年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；腦外傷A 組和B 組受傷至入院采血時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 見表1。

2.2 各組血清miR-16 和miR-92a 表達(dá)量比較 腦外傷A 組和B 組miR-16 的表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組，且腦外傷A 組miR-16 的表達(dá)水平明顯高于腦外傷 B 組。 同樣， 腦外傷 A 組和 B 組 miR-92a的表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組，且A 組miR-16 的表達(dá)水平明顯高于B 組。 見圖1。

表1 腦外傷A、B 組和對(duì)照組的一般臨床資料

2.3 血清miR-16 和miR-92a 表達(dá)量與腦外傷患者傷后6 個(gè)月GOSE 評(píng)分的關(guān)系 Spearman 預(yù)后分析表明，腦外傷患者血清miR-16 和miR-92a 表達(dá)量與其預(yù)后呈負(fù)相關(guān)， 血清內(nèi)miR-16 和miR-92a 表達(dá)量越高， 其預(yù)后越差 （r=-0.74、-0.65，P＜0.05）。 同樣，顱腦 CT 陽性 A 組患者和顱腦 CT 結(jié)果陰性B 組患者血清內(nèi)miR-16 和miR-92a 表達(dá)量均與其預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（r=-0.82、-0.75；r=-0.72、-0.69，P＜0.05）。 見表2。

圖1 Real-time PCR 結(jié)果顯示腦外傷 A 組和 B 組miR-16 和miR-92a 表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（*P＜0.01）；A 組 miR-16 和miR-92a 表達(dá)水平明顯高于 B 組（#P＜0.01）

表2 血清miR-16 和miR-92a 表達(dá)量與腦外傷患者傷后6 個(gè)月GOSE 評(píng)分的關(guān)系

3 討論

目前輕型顱腦損傷診斷主要依據(jù)GCS 評(píng)分和影像學(xué)檢查，但二者皆有其特定的局限性。 GCS 評(píng)分無法適用于復(fù)合傷、飲酒、使用鎮(zhèn)靜劑、精神、智力異常等患者[14]。 CT 掃描是患者入院時(shí)首選檢查方法，但敏感性較低，大多數(shù)輕型顱腦損傷患者影像學(xué)檢查無異常表現(xiàn)。 磁共振成像可以提高對(duì)微小病灶的檢出率，但對(duì)設(shè)備要求高，費(fèi)用高昂，外傷早期很難安排，限制了其廣泛使用[5]。因此尋找微創(chuàng)、快捷、價(jià)格低廉的生物學(xué)標(biāo)志物，對(duì)于輕型顱腦損傷的診斷與治療具有重大意義。 目前，大量研究發(fā)現(xiàn)，許多蛋白分子，如 GFAP、NSE、UCH-L1、MBP 和S100B 等， 在腦外傷患者血清內(nèi)含量明顯增加，并與腦外傷嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)[5]。 但是由于蛋白類分子標(biāo)志物分子量大， 通過血腦屏障困難，特別是對(duì)于影像學(xué)正常的輕型顱腦損傷患者而言，特異性和敏感性很低。 因此，迄今為止，還沒有任何蛋白類標(biāo)志物運(yùn)用于臨床[5]。

miRNA 為小分子單鏈RNA，很容易通過血腦屏障，且在體液內(nèi)含量豐富、性質(zhì)穩(wěn)定，人們已開始研究其在腫瘤、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等疾病診斷中的生物學(xué)標(biāo)志物價(jià)值[8]。 同樣，miRNA作為腦外傷潛在的生物學(xué)標(biāo)志物也引起人們重視。如 2010 年，Redell 等采用 RT-PCR 技術(shù)檢測(cè) 10位重型顱腦損傷患者和10 位輕型顱腦損傷患者外周血108 個(gè)miRNA 的表達(dá)水平，以正常成人和矯形外科創(chuàng)傷患者作為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)輕、重型顱腦損傷患者外周血miR-16 和miR-92a 均發(fā)生明顯變化[12]。 2016 年，Bhomia 等采用 miRNA 芯片檢測(cè)輕、重型顱腦損傷患者血清和腦脊液標(biāo)本，以矯形外科創(chuàng)傷組和健康人群作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)miR-451、 miR-20a 和 miR-92a 等 miRNA 在輕、 重型顱腦損傷患者血清和腦脊液內(nèi)均表達(dá)明顯上調(diào)[7]。 同樣，周小龍等發(fā)現(xiàn)，輕、中、重型創(chuàng)傷性顱腦損傷患者血清內(nèi) miR-93、miR-191、miR-499 表達(dá)水平均顯著性上升， 且治療后臨床療效好患者血清miR-93、miR-191 和miR-499 水平顯著低于臨床療效差的患者[15]；薛全生等發(fā)現(xiàn)，腦外傷后，輕、中、重型顱腦損傷患者血清內(nèi) miR-93、miR-191 和 miR-499 表達(dá)水平也均明顯升高，且重型顱腦損傷組患者表達(dá)最高[16]。 以上研究表明，miRNA 作為一種潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，可能在腦外傷診斷與損傷程度評(píng)估中具有重要意義。

本研究檢測(cè)了輕型顱腦損傷患者傷后早期血清內(nèi)miR-16 和miR-92a 的表達(dá)變化。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康體檢者比較， 腦外傷4h 后CT 陽性患者和CT 陰性患miR-16 表達(dá)量分別為對(duì)照組的6.36 倍和 4.25 倍，miR-92a 的表達(dá)量分別為對(duì)照組的4.48 倍和 3.07 倍，均顯著增高。 Redell 等報(bào)道，在其研究中， 輕型顱腦損傷患者腦損傷后10h 內(nèi)，血清內(nèi)miR-16 和miR-92a 均上升 2.3 倍，與本研究結(jié)果類似；同樣，Bhomia[7]等檢測(cè)了輕型顱腦損傷患者傷后24h（平均時(shí)間為3.1h）血清內(nèi)mi-92a 的表達(dá)水平， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平為健康對(duì)照組的3.77 倍，顯著上調(diào)，同樣與本研究結(jié)果類似。 本研究還發(fā)現(xiàn)顱腦 CT 陽性患者血清內(nèi) miR-16 和miR-92a 表達(dá)量比顱腦CT 陰性患者表達(dá)量明顯升高，提示腦外傷患者血清miR-16 和miR-92a 表達(dá)變化具有潛在的診斷價(jià)值。 此外，本研究發(fā)現(xiàn)，輕型顱腦外傷預(yù)后欠佳者（GOSE 評(píng)分＜8 分）血清miR-16 和miR-92a 表達(dá)水平較預(yù)后良好（GOSE評(píng)分8 分）者明顯增高，提示血清miR-16 和miR-92a 表達(dá)變化可作為輕型顱腦損傷預(yù)后的潛在生物學(xué)指標(biāo)。 然而由于本研究納入研究樣本量相對(duì)較少，且miR-16 和miR-92a 在腦外傷中的具體功能及作用機(jī)制尚不明確，仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)輕型顱腦損傷患者血清內(nèi)miR-16 和miR-92a 表達(dá)水平升高，可作為輕型顱腦損傷診斷與預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。