電針對AD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能、GRIP1、GRIP2蛋白的影響

黃文甫，白小利

（洛陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 洛陽471000）

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的病理學(xué)特征主要為是細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein，Aβ)沉積所致的老年斑(senile plaque，SP)，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元、軸突缺損，以及神經(jīng)元纖維纏結(jié)[1]。AD 是常見于老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，會引起患者老年癡呆，精神行為異常、生活能力下降、記憶力衰退等[2]。

單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (monocyte chemotactic protein-1，MCP-1) 可通過作用炎癥網(wǎng)絡(luò)的起始因子，并誘導(dǎo)炎癥，介導(dǎo)其他炎性介質(zhì)釋放，促進(jìn)炎癥發(fā)生、發(fā)展[3]。 血清中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1，SDF-1） 則具有促星型膠質(zhì)細(xì)胞合成谷氨酸， 并誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞突觸傳遞及神經(jīng)元的興奮等功能[4]。 谷氨酸受體相互作用蛋白(glutamate receptor interacting protein，GRIP) 在 α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙 (α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4 -isoxazole propionate， AMPA)受體在突觸后膜的錨定中起重要作用[5]。

現(xiàn)今對其治療臨床缺乏有效的治療手段和特效藥物，針灸則較多的用于AD 的治療。 由于其有多靶點、多途徑、多層面的優(yōu)勢，治療AD 具有較好的效果。

本研究通過構(gòu)建AD 模型大鼠，研究電針對大鼠的記憶功能的影響及海馬組織中GRIP1、GRIP2蛋白、血清SDF-1 水平、MCP-1 水平的變化意義，報告如下。

1 實驗動物與方法

1.1 實驗動物 選取成年雄性SD 大鼠48 只（SPF級），平均體質(zhì)量 250g±20.0g，喂養(yǎng)于光照間隔 12h、自由進(jìn)食進(jìn)水、相對濕度45%～60%、室溫22℃～25℃的環(huán)境中。

1.2 實驗儀器與藥品 Aβ1-40 購自美國Sigma 公司，Morris 水迷宮、Y 型水迷宮由江蘇賽昂斯生物科技有限公司提供，微量注射器購自北京英偉達(dá)科技有限公司，腦立體定位儀(江灣I 型)為第二軍醫(yī)大學(xué)生理教研室研制，針灸針、電針治療儀購自河南翔宇醫(yī)療設(shè)備股份有限公司，ELISA 試劑盒購自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司。

1.3 造模方法 AD 大鼠造模方法為雙側(cè)海馬區(qū)微量Aβ 注射法:給予大鼠腹腔水合氯醛麻醉后，固定大鼠頭部，清理手術(shù)區(qū)皮膚，消毒后正中切口，顯露前囟，向后3.4mm、旁開1.8mm 進(jìn)行鉆孔操作，設(shè)置2 個對稱孔后，選用1ul Aβ1-4 緩慢注射，完畢后停針5.0min，選用明膠海封閉鉆孔，縫合皮膚，并給予大鼠8 萬U 青霉素肌注，持續(xù)3d。 假手術(shù)組給予同劑量生理鹽水注射操作。

1.4 干預(yù)方法 實驗組：異戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠后，按實驗動物大鼠穴位圖譜取腎俞穴，用30號13mm 不銹鋼毫針平刺5mm， 雙側(cè)腎俞直刺約4.5mm；百會穴平刺約3mm。

電針治療儀操作如下:實驗動物大鼠穴位圖譜[頻率為20Hz 的連續(xù)波，強(qiáng)度控制以大鼠可安靜耐受為準(zhǔn)。每日進(jìn)行一次針刺治療，每次持續(xù)30min，持續(xù) 4～5 周。

除實驗組外，其余各組正常飼養(yǎng)，但保證其與實驗組治療時的姿勢相同，但是不予針刺治療。

1.5 指標(biāo)檢測方法

1.5.1 Morri 水迷宮實驗 大鼠均行給予Morris 水迷宮試驗，實驗持續(xù)5d，記錄每d 各組大鼠的逃避潛伏期。5d 后撤去中央平臺，隨機(jī)將大鼠放于水中，測試各組大鼠760s 內(nèi)跨越原平臺位置的次數(shù)及在原象限停留時間[4]。

1.5.2 免疫組化染色 取大鼠一側(cè)海馬浸入4%中性緩沖甲醛中，浸泡外固定24h，對海馬標(biāo)本進(jìn)行冠狀切片，片厚5um，乙醇脫水-二甲苯透明-浸蠟及石蠟包埋后，連續(xù)切片，后貼片，將附貼好的切片放置在恒溫箱內(nèi)1.5h， 取出后進(jìn)行亞甲藍(lán)和HE 染色。

1.5.3 ELISA 法 在水迷宮試驗后， 斷頭處死大鼠后迅速取海馬組織，提取海馬組織中的總蛋白采用ELISA 加入不同的抗體檢測 GRIP1、GRIP2、SDF-1、MCP-1 水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的行為學(xué)改變 模型組大鼠的平臺搜尋時間顯著的長于空白組和假手術(shù)組（P＜0.05），模型組大鼠的第二象限活動時間、 跨越平臺次數(shù)均顯著的低于空白組和假手術(shù)組（P＜0.05）；實驗組的平臺搜尋時間顯著低于空白組（P＜0.05），實驗組的第二象限活動時間、 跨越平臺次數(shù)顯著高于空白組（P＜0.05）。 見表1。

2.2 各組大鼠的大鼠海馬組織中GRIP1、GRIP2 蛋白表達(dá)比較 模型組大鼠的大鼠海馬組織中GRIP1、GRIP2 蛋白表達(dá)水平低于空白組和假手術(shù)組（P＜0.05）；實驗組的大鼠海馬組織中 GRIP1、GR IP2 蛋白表達(dá)水平顯著高于空白組（P＜0.05）。 見表2、圖1、圖2。

表1 各組大鼠的行為學(xué)改變（±s）

表1 各組大鼠的行為學(xué)改變（±s）

組別 n 平臺搜尋時間（s）第二象限活動時間（s）空白組假手術(shù)組模型組實驗組F 值P 值12 12 12 12 29.6±1.7 29.9±2.0 39.8±2.8 33.0±2.5 11.628＜0.001 13.5±3.0 13.1±2.6 7.5±2.0 11.1±2.3 7.584 0.001跨越平臺次數(shù)（次）1.35±0.33 1.26±0.26 0.63±0.22 1.04±0.25 8.007＜0.001

表2 各組大鼠海馬組織中GRIP1、GRIP2 蛋白表達(dá)水平比較（±s，IOD）

表2 各組大鼠海馬組織中GRIP1、GRIP2 蛋白表達(dá)水平比較（±s，IOD）

組別 n空白組假手術(shù)組模型組實驗組F 值P 值12 12 12 12 GRIP1 蛋白 GRIP2 蛋白169.3±20.5 173.5±19.6 47.3±8.1 100.7±16.4 28.858＜0.001 155.8±24.1 149.4±21.8 50.2±9.7 110.5±18.9 31.175＜0.001

圖1 四組大鼠海馬組織中的GRIP1 蛋白免疫組化染色，A為空白組、B 為假手術(shù)組、C 為模型組、D 為實驗組，（200 倍）

2.3 各組大鼠的大鼠血清MCP-1、SDF-1 水平比較 模型組大鼠的血清MCP-1 水平高于空白組和假手術(shù)組（P＜0.05），模型組大鼠的血清 SDF-1 水平顯著的低于空白組和假手術(shù)組（P＜0.05）；實驗組的血清 MCP-1 水平低于空白組（P＜0.05），實驗組的血清 SDF-1 水平高于空白組（P＜0.05）。 見表3。

圖2 四組大鼠海馬組織中的GRIP2 蛋白免疫組化染色，A為空白組、B 為假手術(shù)組、C 為模型組、D 為實驗組，（200 倍）

表3 各組大鼠血清 MCP-1、SDF-1 水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清 MCP-1、SDF-1 水平比較（±s）

組別 n空白組假手術(shù)組模型組實驗組F 值P 值12 12 12 12 MCP-1（ng/L） SDF-1（ng/L）124.2±5.6 125.0±7.1 144.9±8.0 131.7±6.7 15.694＜0.001 115.8±7.4 113.4±9.0 98.0±8.1 107.6±7.8 20.428＜0.001

3 討論

阿爾茨海默屬于中醫(yī)的健忘、癡呆的范疇，患病的患者肝腎不足、腦髓不充或年邁體虛；或腦神失養(yǎng)、脾腎氣血不足導(dǎo)致[6，7]。 百會穴主健忘、失眠，腎俞穴主耳聾腎虛、虛勞贏瘦，兩者聯(lián)合使用能夠起到補(bǔ)腎填精、氣血得養(yǎng)、髓海得充、開竅醒神的作用[8]。 本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠的平臺搜尋時間顯著的長于空白組和假手術(shù)組（P＜0.05），模型組大鼠的第二象限活動時間、跨越平臺次數(shù)均顯著的低于空白組和假手術(shù)組（P＜0.05）；實驗組的平臺搜尋時間顯著低于空白組（P＜0.05），實驗組的第二象限活動時間、跨越平臺次數(shù)顯著高于空白組（P＜0.05），表明大鼠經(jīng)電針治療后，能夠顯著縮短奧比潛伏期的時間，原象限平臺停留時間和穿越原象限平臺的次數(shù)明顯增高，提示電針可有效增強(qiáng)AD 大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力。

趨化因子在與相應(yīng)的受體作用，可誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞活化，并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及部分神經(jīng)的毒性或保護(hù)效應(yīng)， 最終參與AD 發(fā)生、發(fā)展[9]。與此同時，AD 患者本身也存在某些趨化因子以此表達(dá)情況， 這也將促使患者SDF-1 低表達(dá)和 MCP-1 表達(dá)顯著上升[10，11]。

本研究結(jié)果顯示， 模型組大鼠的血清MCP-1水平高于空白組和假手術(shù)組， 血清SDF-1 水平顯著的低于空白組和假手術(shù)組；實驗組的血清MCP-1 水平低于空白組，血清SDF-1 水平高于空白組，表明電針能夠降低AD 大鼠血清MCP-1 水平，提高血清SDF-1， 可能由于在電針治療后能夠降低MCP-1 等趨化因子的表達(dá)水平， 從而阻止大鼠血清和腦組織中的炎癥反映水平，從而起到保護(hù)腦組織的作用; 由于SDF-1 在調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶功能中具有重要作用，其可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞合成谷氨酸，并以此增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞興奮性，活化整個膠質(zhì)細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)的傳遞功能；SDF-1 還可保護(hù)組織神經(jīng)元，避免神經(jīng)元被β 淀粉樣蛋白沉積而損傷， 從而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的目的，上調(diào)SDF-1 的表達(dá)水平，可能與提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能具有一定的相關(guān)性。

AMPA 受體隨著神經(jīng)元的活動不斷從在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜之間進(jìn)行循環(huán)運動，突觸后膜上該受體的數(shù)目決定神經(jīng)元的興奮度，決定中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響突觸可塑性的程度[12，13]。 GRIP 在 AMPA 受體的插膜過程中起著重要作用，GRIP1、GRIP2， 通過與AMPA 受體亞基GluR2 及GluR3 的C 末端相互作用，從而調(diào)節(jié)AMPA 受體亞基在細(xì)胞膜和突觸后膜上的分布情況，能夠增強(qiáng)AMPA 受體在突觸后膜的聚集分布的穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)突觸的可塑性[14，15]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的大鼠海馬組織中GRIP1、GRIP2 蛋白表達(dá)水平低于空白組和假手術(shù)組; 實驗組的大鼠海馬組織中GRIP1、GRIP2 蛋白表達(dá)水平顯著高于空白組，表明，電針刺激后會增強(qiáng)大鼠海馬組織中GRIP1、GRIP2 蛋白表達(dá)水平，從而增強(qiáng)AMPA 受體亞基在突觸后膜的穩(wěn)定程度和數(shù)目，促使突觸后神經(jīng)元的興奮化，最終增強(qiáng)大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力。

綜上所述， 本研究通過電針刺激AD 大鼠后，觀察其學(xué)習(xí)記憶能力的變化，并分析血清SDF-1、MCP-1 和海馬組織 GRIP1、GRIP2 蛋白表達(dá)水平的變化，表明電針能夠通過改變血清趨化因子的表達(dá)水平、 調(diào)節(jié)腦海馬區(qū)域神經(jīng)元興奮相關(guān)蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而增強(qiáng)大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，對臨床治療AD 具有一定的指導(dǎo)作用。