利用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化二孢擬奧德蘑母種培養(yǎng)基*

蘇楚亮，袁征超，楊昱儀，薛玲娜，盧 意，劉紫荊，劉 然，莫美華

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

二孢擬奧德蘑（Hymenopellis raphanipes）隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）傘菌目（Agaricales）膨瑚菌科（Physalacriceae）[1]。郝艷佳等[2]提出一個(gè)新的分類中Hymenopellis屬為多系類群，其與Protoxerula、粘蘑Mucidula、刺孢Dactylosporina和Ponticulomyces等屬均應(yīng)歸并到小奧德蘑屬（Oudemansiella）中。目前對二孢擬奧德蘑相關(guān)研究較少，國內(nèi)有其粗多糖的提取及應(yīng)用等相關(guān)研究的報(bào)道[3]；國際上對二孢擬奧德蘑的研究還停留在物種鑒定水平，分子及生理活性研究較少，其他學(xué)術(shù)領(lǐng)域未見報(bào)道。通過在前期對二孢擬奧德蘑母種培養(yǎng)基采用單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確培養(yǎng)基中的碳源、氮源、氨基酸、維生素、無機(jī)鹽等成分含量；通過均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究各成分之間的相互作用，從而獲得最佳的母種培養(yǎng)基配方，在為二孢擬奧德蘑的深入研究提供優(yōu)質(zhì)菌種的同時(shí)，也為二孢擬奧德蘑實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

二孢擬奧德蘑（H.raphanipes）（GDMCC No：60886）菌種，原始菌株由莫美華教授及其研究生采自廣西省桂林市貓兒山國家自然保護(hù)區(qū)（N25°52′56.22″，E110°29′32.53″；海拔 1 500 m），由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院應(yīng)用真菌試驗(yàn)室分離、鑒定、保存并提供。

1.2 培養(yǎng)基制備

1.2.1 PDA培養(yǎng)基制備

選取馬鈴薯200 g，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，紗布過濾，加15 g葡萄糖和20 g瓊脂，充分溶解后于121℃滅菌20 min，取出冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 可溶性碳酸鈣清液配制

稱取10 g可溶性輕質(zhì)碳酸鈣，溶于1 L水中，攪拌溶解靜置10 min后取上層清液，添加相應(yīng)量到試驗(yàn)組中。

1.2.3 氨基酸配制

氨基酸的用量極小，在添加氨基酸的過程中，對于難溶性氨基酸，可用熱水溶解稀釋到所需濃度，再添加到培養(yǎng)基中[4]。

1.2.4 維生素配制

維生素用量不多，當(dāng)其以溶液形式存在時(shí)，大多數(shù)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易受到光和熱破壞[5]。因此，應(yīng)在弱光環(huán)境下過濾除菌后現(xiàn)配現(xiàn)用，避免高熱和紫外線等外界環(huán)境影響，盡量保留其有效活性。

1.3 菌種活化

取出5只二孢擬奧德蘑試管種，分別置于10℃、17℃、24℃的生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d，恢復(fù)菌種活性[6-7]。后轉(zhuǎn)接至PDA平板培養(yǎng)基，進(jìn)行菌種活化。從活化菌種中挑選出無污染、菌絲形態(tài)健壯、潔白度好的優(yōu)質(zhì)菌種平板，采用滅菌打孔器將菌種均勻打成0.5 cm的圓片，供后續(xù)試驗(yàn)接種使用[8]。

1.4 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

1.4.1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案的制定

根據(jù)單因素篩選碳源、氮源、氨基酸、維生素、無機(jī)鹽的結(jié)果，選取淀粉、麥芽浸膏、酵母膏、VB1、天冬氨酸、脯氨酸、硫酸銨、碳酸鈣清液、磷酸二氫鉀、硫酸鎂10個(gè)因素作為均勻設(shè)計(jì)的參試因子，每因子設(shè)12個(gè)水平，見表1，采用10因素12水平的均勻設(shè)計(jì)表U12（1210）進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表2，試驗(yàn)方案見表3。按照表3的試驗(yàn)方案配制母種培養(yǎng)基，于121℃滅菌20 min，冷卻備用。

表1 參試因素水平表Tab.1 Levels table of test factors

表2 U12（1210）均勻設(shè)計(jì)表Tab.2Uniform design table of U12（1210）

表3 二孢擬奧德蘑母種培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)方案Tab.3 Optimization scheme of stock medium of Hymenopellis raphanipes

1.4.2 各組分的添加方式

淀粉、麥芽浸膏、酵母膏、脯氨酸、硫酸銨、碳酸鈣清液、磷酸二氫鉀、硫酸鎂直接添加到培養(yǎng)基中進(jìn)行高壓蒸汽滅菌；VB1、天冬氨酸、脯氨酸3種熱敏性的組分通過濾徑為0.22 μm無菌脂溶性過濾器過濾添加到培養(yǎng)基中[9]。

1.4.3 接種培養(yǎng)

每組試驗(yàn)方案設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將優(yōu)質(zhì)菌種平板圓片接種于正中間區(qū)域，后倒置于26℃恒溫生化培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

所有試驗(yàn)均設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，采用DPS v9.5數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析。對均勻設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果使用二次多項(xiàng)式回歸分析方法，通過數(shù)學(xué)模型模擬獲得最優(yōu)配方[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及試驗(yàn)過程中統(tǒng)計(jì)的指標(biāo)潔白度、菌絲密度[11]結(jié)果見表4、圖1。

表4 二孢奧德蘑母種培養(yǎng)基優(yōu)化均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Optimum and uniform design test results for the culture medium of Hymenopellis raphanipes

由表4、圖1可知，試驗(yàn)組8的菌絲生長速度最快，試驗(yàn)試劑對菌絲的促生長作用效果明顯，同時(shí)菌絲潔白度和菌絲密度2個(gè)指標(biāo)的相對值為“最濃密”和“較潔白”，該組試驗(yàn)為直觀最優(yōu)；而試驗(yàn)組12菌絲潔白度和菌絲密度的菌絲生長特征明顯，菌絲生長速度也較快，為了進(jìn)一步驗(yàn)證該試驗(yàn)結(jié)果，可以選擇試驗(yàn)組8和試驗(yàn)組12作為后續(xù)驗(yàn)證試驗(yàn)的試驗(yàn)組。

以表4中數(shù)據(jù)菌絲生長速度為目標(biāo)函數(shù)（Y），用DPS v9.5對數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，所得回歸方程為：

對回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，得到復(fù)相關(guān)系數(shù)R=0.999 999，由此可見，菌絲生長速度與回歸方程中試驗(yàn)因素的含量有緊密的相關(guān)性，其顯著性檢驗(yàn)值F值=49 999.925 0，顯著水平P值=0.003 5＜0.01，剩余標(biāo)準(zhǔn)差SSE=0.000 1，調(diào)整相關(guān)系數(shù)Ra=0.999 989，回歸方程極顯著，說明方程的可信度較高。方程中各項(xiàng)試驗(yàn)因子的回歸系數(shù)和t檢驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 各回歸項(xiàng)的回歸系數(shù)檢驗(yàn)Tab.5 Regression coefficient test of each regression item

由表5可知，方程中有X1（淀粉）與X8（碳酸鈣清液）、X2（麥芽浸膏）與X8（碳酸鈣清液）、X2（麥芽浸膏）與X9（磷酸二氫鉀）、X3（酵母膏）與X5（天冬氨酸）、X3（酵母膏）與X6（脯氨酸）、X4（硫酸銨）與X10（硫酸鎂）、X6（脯氨酸）與 X10（硫酸鎂）共7組的交互作用及X2（麥芽浸膏）、X4（硫酸銨）2因素的平方項(xiàng)P值均顯著水平小于0.01，說明他們對菌絲生長速度影響很大，達(dá)到極顯著水平。樣本的觀察值、擬合值和擬合誤差見表6。

由表6數(shù)據(jù)顯示，觀察值與擬合值接近，最大擬合誤差絕對值僅為0，進(jìn)一步說明了回歸方程的準(zhǔn)確性。

2.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證

通過DPS v9.50進(jìn)行回歸分析，并通過數(shù)學(xué)模型模擬得到二孢擬奧德蘑母種培養(yǎng)基的理論最優(yōu)組合試驗(yàn)方案見表7，將其與組間最優(yōu)配方8、配方12和真菌通用培養(yǎng)基PDA進(jìn)行對比培養(yǎng)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果見表8、圖2。

表6 配方的觀察值、擬合值和擬合誤差Tab.6 Observed value,fitted value and fitted error of the samples

表7 二孢擬奧德蘑優(yōu)化培養(yǎng)基配方驗(yàn)證試驗(yàn)方案Tab.7 The validation test scheme of the optimum stock medium of Hymenopellis raphanipes

表8 二孢擬奧德蘑優(yōu)化培養(yǎng)基配方驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.8 Results of validation test of the optimum stock medium of Hymenopellis raphanipes

由表8、圖2可知，在理論最優(yōu)配方的培養(yǎng)基中，二孢擬奧德蘑菌絲生長速度最快，菌絲密度和潔白度最高；其次為組間最優(yōu)配方8和配方12，而PDA培養(yǎng)基生長速度最慢，且理論最優(yōu)與配方8、PDA培養(yǎng)的二孢擬奧德蘑菌絲生長速度存在顯著差異，而配方8與配方12、配方12與PDA培養(yǎng)菌絲生長速度無顯著差異。因此，二孢擬奧德蘑菌絲生長最適母種培養(yǎng)基為理論最優(yōu)配方，每升培養(yǎng)基中含淀粉27.50 g、酵母膏5.50 g、硫酸銨1.10 g、天冬氨酸0.02 g，脯氨酸 220.00 μg、VB11.44 μg、可溶性碳酸鈣清液11.00 g、磷酸二氫鉀10.97 g。

2.3 培養(yǎng)基中硫酸銨（X4）與二孢擬奧德蘑生長速度的關(guān)系

通過DPS v9.50對10個(gè)參試因子進(jìn)行單因素變量與生長關(guān)系的分析可知，當(dāng)培養(yǎng)基中添加一定濃度的硫酸銨時(shí)，促進(jìn)菌絲的生長，取其作為單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，培養(yǎng)基中硫酸銨濃度（X4）與二孢擬奧德蘑生長速度相關(guān)性見圖3。

從圖3中可以看出，二孢擬奧德蘑的生長與硫酸銨有較強(qiáng)的相關(guān)性，硫酸銨濃度在一定范圍內(nèi)，隨著添加量的增加能明顯促進(jìn)菌絲生長，表現(xiàn)為較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系。在菌絲利用培養(yǎng)基成分的過程中，硫酸銨主要提供游離的NH4+，有利于菌絲直接吸收和轉(zhuǎn)化氮源，進(jìn)而提高菌絲的生長速度和生物轉(zhuǎn)化率[12]。因此在二孢擬奧德蘑菌絲培育的過程中，可合理添加適量的硫酸銨，有利于培育出優(yōu)質(zhì)的菌種。

3 結(jié)論

近年來，國內(nèi)對小奧德蘑屬的部分菌株已實(shí)現(xiàn)了人工馴化栽培[13]，二孢擬奧德蘑菌株屬于新發(fā)現(xiàn)的小奧德蘑屬真菌，目前對其相關(guān)研究較少，通過在前期對母種培養(yǎng)基單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進(jìn)行均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化，從而確定二孢擬奧德蘑最佳的母種培養(yǎng)基配方，為二孢擬奧德蘑的深入研究提供理論依據(jù)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，小奧德蘑屬的大多數(shù)種如厚褶小奧德蘑（O.crassifolia）、鱗柄小奧德蘑（O.furfuracea） 等[14-16]可食用，粘小奧德（O.raphanipes）[18]等種甚至可能會成為重要的藥用菌種；目前已有的資料表明[3]，二孢擬奧德蘑富含粗多糖，其相關(guān)成分具有一定的藥理價(jià)值。

均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)組8和試驗(yàn)組12的二孢擬奧德蘑菌絲生長最佳，菌絲潔白度、菌絲密度指標(biāo)優(yōu)良，同時(shí)結(jié)合DPS v9.50顯著性分析，理論最優(yōu)的的試驗(yàn)配方生長效果顯著，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于試驗(yàn)組8和試驗(yàn)組12；再結(jié)合驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果，可以明顯看出理論最優(yōu)組配方為最佳配方。因此確定二孢擬奧德蘑母種培養(yǎng)基最佳配方為：每升培養(yǎng)基中含淀粉27.50 g、酵母膏5.50 g、硫酸銨1.10 g，天冬氨酸 0.017 g，脯氨酸 220.00 μg、VB11.44 μg，可溶性碳酸鈣清液11.00 g、磷酸二氫鉀10.97 g。此外，在二孢擬奧德蘑母種培養(yǎng)基優(yōu)化的試驗(yàn)因子中，硫酸銨的適量添加能夠明顯促進(jìn)菌絲生長，有利于培育優(yōu)質(zhì)的二孢擬奧德蘑母種。

與目前大多可商業(yè)化栽培的奧德蘑屬的母種培養(yǎng)基相比，試驗(yàn)所得的母種培養(yǎng)基配方具有成分明確、碳氮比合適、無機(jī)鹽成分合理、生長因子添加量適宜等優(yōu)點(diǎn)[19-20]，避免了母種培育過程中培養(yǎng)基成分的盲目添加，有利于生物轉(zhuǎn)化率的提升和菌絲形態(tài)特征等指標(biāo)的優(yōu)化，避免菌種傳代過程菌種退化現(xiàn)象并促進(jìn)其優(yōu)良性狀的表達(dá)[21]，從而為二孢擬奧德蘑優(yōu)良菌種的培育提供保障，有利于提高二孢擬奧德蘑出菇時(shí)的生物轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而培育出優(yōu)質(zhì)的二孢擬奧德蘑子實(shí)體，為其商業(yè)化栽培提供理論依據(jù)。