響應(yīng)面法優(yōu)化白云參總皂苷的提取工藝

周興卓 王莉娜 沈麗霞 ＊

（1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266000；2.解放軍第 971 醫(yī)院，山東 青島 266072）

0 引言

白云參，始載于《植物名實(shí)圖考》，又名土黨參，金錢豹等。 系桔?？平疱X豹屬植物大花金錢豹Camp anumoea javanica Blume 的根[1]。 性甘，平，無毒。 具有健脾胃、潤肺生津之功效。 臨床上常用于肺虛咳嗽、脾虛泄瀉、小兒疳積、遺尿等疾病的治療[2]。 研究表明，白云參中主要含有皂苷、黃酮和多糖等類化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、抗氧化、抗病毒等多種藥理活性[3-4]。目前，白云參中總皂苷的提取工藝研究還未見報(bào)道。 因此，本試驗(yàn)利用響應(yīng)面法對白云參總皂苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為白云參藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材與試劑

白云參（批號：190916，云南福堂中藥飲片科技有限公司）；黨參苷I（批號20190927，愛必信生物科技有限公司），試劑均為分析純。

1.2 儀器

UV-2100 紫外分光光度計(jì)（日本島津有限公司）；KQ-600KDE 型超聲機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；SB-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞龍儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 總皂苷的提取

精精密稱取粉碎后的白云參粉末2.0 g，置于50 mL錐形瓶中，加入70%乙醇25 mL，超聲提取30 min，經(jīng)不同提取時(shí)間、不同提取溫度、不同料液比提取后，過濾，減壓干燥，濃縮至浸膏，加入10 mL 純水溶解、搖勻，再加入等體積的水飽和正丁醇萃取，萃取3 次，合并正丁醇萃取液，減壓蒸餾干燥，即得總皂苷。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取黨參苷I 對照品5.0 mg，置于25 mL 量瓶中，加入70%乙醇溶液溶解定容，得對照品溶液。準(zhǔn)確移取 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于 25 mL 量瓶中，把對照溶液水浴揮干，再精密加入新配制的5%香草醛-冰醋酸0.2 mL 和高氯酸溶液0.8 mL，加塞后，搖勻，在 60 ℃水浴中進(jìn)行加熱15 min，取出冷卻，再加入5 mL 的冰醋酸，搖勻，在550 nm 處測定吸光度。 以吸光度A 對質(zhì)量濃度C 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得A=0.0085C-0.062（r=0.9994），線性關(guān)系良好。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過單因素法，對不同提取時(shí)間（5、15、30、45、60 min），不同提取溫度（30、40、50、60、70℃）和不同液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）進(jìn)行考察，結(jié)果顯示提取時(shí)間為 30 min， 提取溫度為 60℃， 液料比為 25∶1時(shí)提取效率最高。

3.2 Box-Behnken 試驗(yàn)

以提取時(shí)間（A）、提取溫度（B）和液料比（C）為自變量，以白云參總皂苷得率為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)3 因素3 水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，因素水平表見表1。

表1 因素水平表

3.3 數(shù)據(jù)分析

用Design-Expert 8.05 進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，得到總皂苷提取率對編碼自變量A、B 以及C 的二次多元回歸擬合分析方程：Y=0.75-0.034A+0.13B+0.085C-0.035AB-0.083AC-0.037BC-0.18A2-0.13B2+0.003C2，該模型回歸顯著（P＜0.0001），模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.9907，說明該回歸方程回歸效果較好，模型可信度高，失擬項(xiàng)的P＞0.05，說明模型極顯著，可用來進(jìn)行應(yīng)值的預(yù)測，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案正確。

3.4 響應(yīng)面分析

通過多元回歸方程作響應(yīng)面圖，可以較直觀地反映各因素間的交互作用。 結(jié)果圖見圖1、圖2 和圖3。

圖1 總皂苷得率與提取時(shí)間和提取溫度之間的交互影響

圖2 總皂苷得率與提取時(shí)間和液料比之間的交互影響

圖3 總皂苷得率與提取溫度和液料比之間的交互影響

3.5 結(jié)果驗(yàn)證

通過軟件Design-Expert 分析得出白云參總皂苷最佳提取工藝為：提取時(shí)間23.79 min，提取溫度69.77℃和液料比29.79。綜合考慮到實(shí)際操作方便，調(diào)整最佳工藝為：提取時(shí)間25 min，提取溫度70℃和液料比30。 按照此工藝進(jìn)行3 次工藝驗(yàn)證試驗(yàn)，預(yù)測值為0.92%，實(shí)際值為0.93%，非常接近。 說明響應(yīng)面法能較好地預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果。

4 討論

Box-Behnken 設(shè)計(jì)采用多元二次回歸的方法，將多因子實(shí)驗(yàn)中因子指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式擬合，通過對函數(shù)響應(yīng)面和等高線的分析，能夠精確地研究各因子與響應(yīng)值的關(guān)系，與正交設(shè)計(jì)相比，所得結(jié)果更直觀，可很好的用于中藥有效成分的提取工藝優(yōu)化。