痛風(fēng)及高尿酸血癥患者HLA-B*5801 基因攜帶情況及其與別嘌醇過(guò)敏反應(yīng)間的相關(guān)性研究*

張衛(wèi)忠，施春花，王友蓮

(江西省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，南昌330006）

別嘌醇是一種黃嘌呤氧化酶抑制劑， 能有效減少尿酸合成，作為降尿酸藥物療效顯著、價(jià)格低廉，在臨床上廣泛用于治療高尿酸血癥、痛風(fēng)和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等疾病。 然而在使用過(guò)程中，別嘌醇容易引起各種不良反應(yīng)，有常見(jiàn)的藥疹、發(fā)熱、肝腎功能損害及血液系統(tǒng)損害[1]；也有嚴(yán)重的皮膚不良反應(yīng)， 如中毒性表皮壞死松解癥(toxic epidermal necrolysis，TEN)、 重 癥 滲 出 性 多 形 紅 斑 藥 疹(Stevens-Johnson syndrome，SJS) 及超敏綜合征(hypersensitivity syndrome，HSS)等，發(fā)病率約5%，病死率高達(dá)30%-50%[2]。 近年來(lái)，別嘌醇的過(guò)敏反應(yīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。 2005 年，Hung 等[3]報(bào)道臺(tái)灣人群使用別嘌醇治療而產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)與HLA-B*5801 等位基因之間存在相關(guān)性， 隨后國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[4-7]也有相關(guān)報(bào)道。2013 年的《高尿酸血癥和痛風(fēng)治療中國(guó)專家共識(shí)》中推薦痛風(fēng)及高尿酸血癥患者使用別嘌醇前檢測(cè)HLA-B*5801 基因。最新的美國(guó)臨床藥理學(xué)治療指南[8]也提出在口服別嘌呤醇之前對(duì)患者進(jìn)行HLA-B*5801 基因型檢測(cè)是很有必要的， 等位基因型陽(yáng)性者不主張服用別嘌醇，建議服用其他替代藥物。 但是不同地區(qū)、國(guó)家、 種族之間，HLA-B*5801 基因攜帶情況以及其別嘌醇相關(guān)藥疹之間的關(guān)聯(lián)性差異很大， 而且中國(guó)很多地區(qū)缺乏HLA-B*5801 基因攜帶情況的研究分析， 尤其是江西省內(nèi)各地區(qū)缺乏該基因流行性的調(diào)查。而且很少有醫(yī)院開(kāi)展該基因檢測(cè)。由于HLA-B*5801 基因檢測(cè)比較昂貴， 很多痛風(fēng)及高尿酸血癥患者考慮經(jīng)濟(jì)原因?qū)υ擁?xiàng)檢測(cè)比較顧慮。 本研究希望通過(guò)調(diào)查南昌市痛風(fēng)及高尿酸血癥患者HLA-B*5801 基因攜帶情況及與別嘌醇相關(guān)藥疹之間的相關(guān)性， 來(lái)指導(dǎo)本地痛風(fēng)及高尿酸血癥患者選用合適藥物治療。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象為在2018 年6 月至2019年1 月期間就診于江西省人民院的痛風(fēng)及高尿酸血癥患者。 其中痛風(fēng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2015 年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)/歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟痛風(fēng)分類標(biāo)準(zhǔn)[9]；高尿酸血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)： 男420μmol/L （7mg/L）， 女360 μmol/L（6mg/L）。入選患者年齡18-75 歲。將服用別嘌醇的痛風(fēng)及高尿酸血癥患者分為兩組， 其中服用別嘌醇而過(guò)敏的11 例患者納入別嘌醇過(guò)敏組；服用別嘌醇超過(guò)6 個(gè)月但未發(fā)生任何不良反應(yīng)的患者21 例納入別嘌醇耐受組；在江西省人民醫(yī)院就診且未服用過(guò)別嘌醇的痛風(fēng)及高尿酸血癥患者共80 例納入對(duì)照組。 詳細(xì)記錄受試者的相關(guān)資料，包括性別、年齡、家庭住址、民族、臨床診斷、藥物使用情況、 出現(xiàn)的藥物不良反應(yīng)情況及相應(yīng)的治療情況等。 所有受試者均知情同意并簽署了知情同意書(shū)，且通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)。

1.2 方法 使用EDTA 抗凝管采集各受試者靜脈血3mL，提取血液DNA，并測(cè)定DNA 濃度和純度，利用安徽同科生物科技有限公司的人類HLAB*5801 基因檢測(cè)試劑盒（PCR 多色熒光法） 進(jìn)行HLA-B*5801 等位基因檢測(cè)。 其中該試劑盒針對(duì)HLA-B*5801 等位基因設(shè)計(jì)了一套特異性引物和探針組合， 在一個(gè)反應(yīng)體系中利用兩熒光通道檢測(cè)目標(biāo)基因。 在反應(yīng)體系含有對(duì)應(yīng)基因型模板的情況下，PCR 反應(yīng)得以進(jìn)行，并利用熒光定量PCR儀對(duì)反應(yīng)過(guò)程中釋放出的相應(yīng)熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)HLA-B*5801 等位基因的檢測(cè)。其中JOE 熒光為內(nèi)參基因信號(hào)，ROX 和FAM 為HLA-B*5801 等位基因信號(hào)。檢測(cè)過(guò)程中所有操作均由經(jīng)培訓(xùn)后的專人嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

結(jié)果判讀：FAM、JOE 和ROX 的Ct 值均≤38，HLA-B*5801 陽(yáng)性； 其中JOE≤38，F(xiàn)AM 或ROX不均≤38，HLA-B*5801 陰性；若JOE（內(nèi)參）Ct 值＞38，可能存在PCR 抑制，需對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher確切概率法和卡方檢驗(yàn)。HLA-B*5801 等位基因與別嘌醇過(guò)敏間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度使用比值比 （odds ratio,OR）和95%可信區(qū)間（confidence interval,CI）反映。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HLA-B*5801 等位基因陽(yáng)性判斷別嘌醇過(guò)敏的敏感度=別嘌醇過(guò)敏組HLA-B*5801 陽(yáng)性數(shù)/別嘌醇過(guò)敏組總?cè)藬?shù)×100%；HLA-B*5801 等位基因陰性判斷別嘌醇耐受的特異度=別嘌醇耐受組HLA-B*5801 陰性數(shù)/別嘌醇耐受總?cè)藬?shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 HLA-B*5801 等位基因檢測(cè)情況 所有受試者的內(nèi)參基因（JOE）全部擴(kuò)增，且Ct 值均＜38，受試者檢測(cè)結(jié)果根據(jù)HLA-B*5801 檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行判讀。 112 位受試者中，HLA- B*5801 等位基因陽(yáng)性23 例（占20.5%），其中男性有16 例，女性7 例；HLA- B*5801 等位基因陰性89 例（占79.5%），其中男56 例，女33 例，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 HLA-B*5801 等位基因檢測(cè)情況n（%）

圖1 HLA-B*5801 基因檢測(cè)擴(kuò)增圖（左：陽(yáng)性/右：陰性）

在檢測(cè)結(jié)果中， 隨機(jī)選取了HLA-B*5801 等位基因陽(yáng)性、陰性的擴(kuò)增結(jié)果各1 例，見(jiàn)圖1。由圖知，兩受試者的內(nèi)參基因（JOE）熒光通道均有曲線擴(kuò)增，Ct 值在34 左右，小于38，檢測(cè)有效，其中一受試者的HLA-B*5801 基因（FAM 和ROX）熒光通道有擴(kuò)增曲線，Ct 值在32 左右， 小于38，HLAB*5801 等位基因陽(yáng)性； 而另一受試者的HLAB*5801 基因（FAM 和ROX）熒光通道無(wú)擴(kuò)增曲線，HLA-B*5801 等位基因陰性。

2.2 別嘌醇過(guò)敏與HLA-B*5801 基因相關(guān)性 別嘌醇過(guò)敏組受試者HLA-B*5801 等位基因陽(yáng)性率為90.9%（10/11）， 別嘌醇耐受組受試者HLAB*5801 等位基因陽(yáng)性率為9.5%（2/21），對(duì)照組受試者HLA-B*5801 等位基因陽(yáng)性率為13.8%（11/80）； 別嘌醇過(guò)敏組與別嘌醇耐受組比較，HLAB*5801 等位基因陽(yáng)性者發(fā)生別嘌醇過(guò)敏的風(fēng)險(xiǎn)是HLA-B*5801 等位基因陰性者的95 倍 （OR=95，95% CI:7.6-1180.3，P＜0.001）， 該基因陽(yáng)性判斷別嘌醇過(guò)敏的敏感度為90.9%，該基因陰性判斷別嘌醇耐受的特異度為90.5%。別嘌醇過(guò)敏組與健康對(duì)照組比較，HLA-B*5801 等位基因陽(yáng)性者發(fā)生別嘌醇過(guò)敏的風(fēng)險(xiǎn)是HLA-B*5801 等位基因陰性者的62.7 倍（OR=62.7，95% CI:7.3-539.5，P＜0.001）（表2）。

3 討論

表2 各組攜帶HLA-B*5801 等位基因情況

在本研究中,健康對(duì)照組HLA-B*5801 等位基因陽(yáng)性率為13.8%, 與國(guó)內(nèi)人群的陽(yáng)性率14%-20%[3-5]相似，顯著高于歐洲（0.8%）及日本（0.6%）[2]，但低于曾大勇[10]等的研究(20.4%)，與不同地區(qū)人群的HLA-B*5801 等位基因攜帶率有差異理論相符[11]。 關(guān)于不同地區(qū)有不同的攜帶率的研究，后續(xù)可針對(duì)不同地域區(qū)內(nèi)的受試者進(jìn)行深入探究。HLA-B*5801 該標(biāo)志基因的危險(xiǎn)度（OR=95）低于Hung 等[3]（OR=580.3）及高杰等[2]（OR=403），但 高于曾大勇等[10]（OR=65.6），可能與研究的樣本數(shù)量及區(qū)域位置有關(guān)， 該研究證明HLA-B*5801 等位基因與別嘌醇過(guò)敏之間有關(guān)聯(lián)。

研究所用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入針對(duì)HLA-B*5801 等位基因設(shè)計(jì)了一套特異性引物和探針組合， 且反應(yīng)體系中加入了對(duì)內(nèi)參基因的檢測(cè)，能夠更好的對(duì)樣本DNA 的提取及擴(kuò)增進(jìn)行監(jiān)控，避免假陰性結(jié)果，提高試驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。 熒光定量PCR 比常規(guī)PCR 特異性更強(qiáng)、靈敏度更高、分析結(jié)果快速，而且整個(gè)PCR 反應(yīng)過(guò)程均在完全閉管狀態(tài)下進(jìn)行， 無(wú)需冗長(zhǎng)的后處理， 有效避免了常規(guī)PCR 產(chǎn)物造成的潛在實(shí)驗(yàn)室污染問(wèn)題。

近年來(lái)，由于肥胖、腎功能不全及高血壓發(fā)病率逐年上升,高尿酸血癥及痛風(fēng)的發(fā)病率也隨之上升。根據(jù)《2016 年中國(guó)痛風(fēng)指南》[12]，我國(guó)不同地區(qū),不同時(shí)間段痛風(fēng)患病率在1%-3%， 且呈逐年上升趨勢(shì)[13]。別嘌醇作為降尿酸、治療痛風(fēng)的一線藥物，特別受人們的青睞,然而別嘌醇引起的嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)成為臨床應(yīng)用的難題。 在江西地區(qū)，痛風(fēng)及高尿酸血癥的發(fā)病率高, 但存在很多患者未規(guī)律就診，包括不規(guī)范使用藥物及監(jiān)測(cè)血尿酸指標(biāo)等。 在使用別嘌醇前很少患者曾檢測(cè)過(guò)HLA-B*5801 等位基因，存在用藥風(fēng)險(xiǎn)[14]。 本研究及其他研究[2-3,5-7,15,16]都已證實(shí)HLA-B*5801 等位基因與別嘌醇過(guò)敏有很強(qiáng)的相關(guān)性， 且HLA-B*5801 等位基因陽(yáng)性率在亞裔漢族人群中具有相當(dāng)高的比例[14]，對(duì)即將服用別嘌醇的病患者進(jìn)行HLA-B*5801 等位基因的檢測(cè)，有助于降低別嘌醇過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生，指導(dǎo)患者安全合理用藥。