基于溶菌酶釋放蛋白的豬鏈球菌間接ELISA 抗體檢測方法的建立

喬 宏，龔 俊，欒 慧，李 剛，劉思國，王春來

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/動物細(xì)菌病創(chuàng)新團(tuán)隊，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，可導(dǎo)致患病豬出現(xiàn)敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、突然死亡等病癥[1-2]。同時，SS 也是一種重要的人獸共患病病原菌。江蘇省1998 年暴發(fā)的豬鏈球菌2 型（SS2）疾病造成了大量豬死亡[3]；四川省2005 年暴發(fā)的SS2 疾病共導(dǎo)致了38 人死亡[4]。根據(jù)SS 莢膜多糖抗原成分的差異可將其分為33 個血清型（1～31 型、33 型、 1/2 型），但之后，20、22、26 和33 型被重新劃分為其它鏈球菌屬，剩下的29 個血清型被認(rèn)為是真正的SS[5-8]。其中2 型流行最廣且分離率最高[9]，感染了SS2 的病豬在未接受任何治療的情況下死亡率一般可達(dá)到20%[10]，給養(yǎng)豬行業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，SS2 經(jīng)常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、副豬嗜血桿菌（HPS）和豬圓環(huán)病毒（PCV）等發(fā)生混合感染[11-13]，給臨床診斷及治療造成了很大困難。因此，建立一種簡單、準(zhǔn)確并且快速的診斷方法對該病的防治具有非常重要的意義。

溶菌酶釋放蛋白（Muramidase-released protein，MRP）基因是在SS2、6 型（SS6）、7 型（SS7）、8 型（SS8）、9 型（SS9）、12 型（SS12）、13 型（SS13）、16型（SS16）以及24 型（SS24）等不同血清型的菌株中高度保守的一個基因，該基因編碼的MRP 蛋白含有多個抗原表位，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體。有研究在分析了近180 株SS2 菌株后發(fā)現(xiàn)，從病豬分離的SS2 菌株中有77%為mrp+ef+，分離自病人的SS2菌株中有89%表達(dá)MRP，而86%的健康豬分離菌株則為mrp-ef-[14]。表明MRP 與SS 的致病性密切相關(guān)。歐瑜等對SS2 HA9801 株mrp基因的298 bp～827 bp 區(qū)域的序列進(jìn)行克隆表達(dá)，試驗結(jié)果表明通過純化獲得的融合蛋白能夠被MRP 抗血清識別[15]，表明表達(dá)的MRP 蛋白具有較好的反應(yīng)原性。另有研究以重組MRP 蛋白免疫BALB/C 小鼠，在隨后的攻毒實驗中有62.5%的小鼠得以存活[16]，表明MRP 蛋白也具有較好的免疫原性。

本研究選取SSmrp基因2 617 bp～3 710 bp 區(qū)域的抗原片段經(jīng)原核表達(dá)，并將純化后的重組MRP蛋白（rMRP）作為包被抗原建立了檢測SS2、SS7、SS9 和SS12血清抗體的間接ELISA方法（rMRP-ELISA），以期為SS病的血清流行病學(xué)調(diào)查提供可靠的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 菌株和血清 SS2、SS7、SS9和SS12菌株由本實驗室分離保存；HPS、胸膜肺炎放線桿菌（APP）、多殺巴氏桿菌（PM）、大腸桿菌（E. coli）、以及SS 陰性血清由本實驗室保存；豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、輪狀病毒（RV）、流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬呼吸與繁殖綜合征病毒（PRRSV）陽性血清及部分SS 陽性血清由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所相關(guān)實驗室提供；不同血清型SS 人工免疫陽性血清（SS2、SS7、SS9 和SS12）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)和廣東動物衛(wèi)生防治所提供。待檢臨床豬血清中100 份來自內(nèi)蒙古某動物疾病診斷中心、240 份來自哈爾濱獸醫(yī)研究所動物衛(wèi)生檢測中心、另外200 份來自寶士德生物科技有限公司送檢的臨床豬血清。

1.2 主要試劑 rMRP 為本實驗室制備并保存，濃度為0.4 mg/mL；THB 培養(yǎng)基和脫脂乳購自美國BD公司；BamHⅠ、SalⅠ、T4 DNA 連接酶、ExTaqDNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、HRP-DAB 增強(qiáng)型底物顯色試劑盒購自天根生化科技有限公司；膠回收和質(zhì)粒微提試劑盒均購自O(shè)mega 公司；兔抗豬HRP-IgG 購自Abcam公 司；DNA Maker 購自Coolaber 公司；蛋白Maker 購自賽默公司； NC 膜及Ni-NTA his Bind 親和樹脂購自GE 公司；蛋白預(yù)制膠購自金斯瑞（南京）生物技術(shù)有限公司。

1.3 rMRP-ELISA 條件優(yōu)化 通過棋盤法確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)。用0.05 mol/L pH 9.6 碳酸鹽緩沖液作為包被液，將純化的rMRP 5 倍倍比稀釋（0.25 μg/mL、0.05 μg/mL、0.01 μg/mL和0.002 μg/mL），再以100 μL/孔橫向加入酶標(biāo)板，4 ℃包被過夜。將SS2 陽性和陰性豬血清以1 100、1 200、1 300、1 400 稀釋后進(jìn)行方陣試驗。每個稀釋度陰陽性對照各設(shè)2 孔，之后利用酶標(biāo)儀測定SS2 陽性和陰性血清的OD450nm值，以P/N 值（陽性血清OD450nm/陰性血清OD450nm）最大時的反應(yīng)條件為最佳工作條件。同樣對封閉液（5%魚皮明膠、5%脫脂乳、5%馬血清、5%BSA、1%海藻糖、5%魚皮明膠+5%馬血清、5%脫脂乳+5%魚皮明膠、5%馬血清+0.5%BSA、5%脫脂乳+0.5%BSA 和5%魚皮明膠+1%海藻糖）及封閉條件（37 ℃2 h、37 ℃過夜、4 ℃2 h 和4 ℃過夜）、待檢血清作用時間（0.5 h、1 h、1.5 h 和2 h）、兔抗豬IgG-HRP 稀釋倍數(shù)（1 5 000、1 10 000、1 15 000 和1 20 000）及作用時間（0.5 h、1 h、1.5 h 和2 h）、底物顯色時間（5 min、10 min、15 min、20 min）等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 臨界值的確定 利用優(yōu)化后的rMRP-ELISA 方法檢測背景明確的60 份SS 陰性血清，計算出這60份血清的平均OD450nm值（-X）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），當(dāng)待檢血清平均OD450nm值≥-X+3SD 時判定為陽性，當(dāng)待檢血清平均OD450nm值<-X+3SD 時判定為陰性[17]。

1.5 特異性試驗 利用優(yōu)化之后的rMRP-ELISA 方法檢測100 份已知的SS 陰性血清樣品，根據(jù)檢出的陰性血清份數(shù)計算該方法的特異性；同時，利用優(yōu)化之后的rMRP-ELISA 方法，對HPS、APP、PM、E. coli、TGEV、RV、PEDV、PRRSV、SS7、SS9 和SS12 的陽性血清進(jìn)行檢測，并設(shè)SS2 陽性血清作為陽性對照，每個樣品均設(shè)2 個重復(fù)。計算待檢血清的OD450nm均值，評估其特異性。

1.6 敏感性試驗 利用優(yōu)化之后的rMRP-ELISA 方法，檢測50 份已知的SS 陽性血清樣品，根據(jù)檢出的陽性血清份數(shù)計算該方法的敏感性；將SS2 陽性血清2 倍倍比稀釋（1 50～1 6 400），利用該rMRPELISA 方法檢測，每個稀釋度及陰陽性對照血清均設(shè)2 個重復(fù)。測定各血清樣品的OD450nm值并計算各待檢血清的OD450nm均值，評估該方法的敏感性。

1.7 重復(fù)性試驗 批內(nèi)重復(fù)性試驗：隨機(jī)選取背景清楚的4 份SS2 陽性血清和2 份SS 陰性血清，利用同一批次制備的rMRP-ELISA 板進(jìn)行檢測，每份血清樣品做6 次重復(fù)，計算其平均值，并對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算批內(nèi)變異系數(shù)；批間重復(fù)性試驗：利用不同批次包被的rMRP-ELISA 板對上述4份SS2 陽性血清和2 份SS 陰性血清樣品進(jìn)行檢測，每份血清樣品做6 次重復(fù)，計算其平均值，并對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計算批間變異系數(shù)。評估該方法的重復(fù)性。

1.8 符合率試驗 由于目前市售的檢測SS血清抗體的ELISA 商品化試劑盒較少，僅有的一種檢測效果也不是很理想。所以本研究利用玻片凝集試驗對本實驗建立的rMRP-ELISA 方法做符合率試驗。將在固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)的12 h～24 h的SS2 05ZYH33株、SS7 ZZ-6-6 株、SS9 GZ-2 株和SS12 GZ-8 株作為標(biāo)準(zhǔn)凝集原，SS2、SS7、SS9、SS12 陽性血清以及SS 陰性血清分別作為陽性對照和陰性對照，且均設(shè)2 個重復(fù)。

分別利用rMRP-ELISA 和玻片凝集兩種方法同時檢測100 份來自內(nèi)蒙古某動物疾病診斷中心的臨床豬血清樣品抗體并計算二者的符合率。

1.9 臨床樣品檢測 利用本研究建立的rMRP-ELI?SA 方法對哈爾濱獸醫(yī)研究所動物衛(wèi)生檢測中心的240 份臨床豬血清以及寶士德生物科技有限公司送檢的200 份臨床豬血清進(jìn)行檢測，統(tǒng)計血清抗體陽性率。

2 結(jié) 果

2.1 rMRP-ELISA 最佳反應(yīng)條件的確定 采用方陣滴定法優(yōu)化ELISA 反應(yīng)條件，以P/N 值最大者為最佳條件，優(yōu)化結(jié)果見表1。

2.2 臨界值的確定 利用建立的rMRP-ELISA 方法檢測背景明確的60 份SS 陰性血清，經(jīng)計算這些陰性血清平均OD450nm值為0.193，標(biāo)準(zhǔn)差為0.011，陰陽性臨界值=0.193+3×0.011=0.226。當(dāng)樣品OD450nm平均值≥0.226 判定為陽性，當(dāng)樣品OD450nm平均值<0.226 判定為陰性。

表1 rMRP-ELISA 檢測方法反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of the rMRP-ELISA

2.3 特異性試驗結(jié)果 利用優(yōu)化之后的rMRP-ELI?SA 方法對100 份已知的SS 陰性血清進(jìn)行檢測，檢出97 份陰性、3 份陽性血清，因此該方法的特異性為97%；利用本研究建立的ELISA 方法檢測HPS、APP、PM、E. coli、TGEV、RV、PEDV 和PRRSV 陽性血清，檢測這些陽性血清樣品的OD450nm平均值均小于0.226，判定為陰性；而SS7、SS9 和SS12 陽性血清的OD450nm平均值均大于0.226，判定為陽性（表2）。表明本研究建立的ELISA 方法具有較強(qiáng)的特異性。

2.4 敏感性試驗結(jié)果 利用優(yōu)化之后的rMRP-ELI?SA 方法對50 份已知的SS 陽性血清進(jìn)行檢測，檢出48 份陽性、2 份陰性血清，因此該方法的敏感性為96%；同時，利用本研究建立的ELISA 方法對1 50～1 6 400 稀釋的SS2 陽性血清進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，當(dāng)血清稀釋度為1 3 200時，其結(jié)果仍為陽性（表3），表明該方法具有較高的敏感性。

表2 特異性試驗結(jié)果Table 2 Specificity test results

表3 敏感性試驗結(jié)果Table 3 Sensitivity test

2.5 重復(fù)性試驗結(jié)果 將不同抗體水平的4 份SS2陽性血清和2 份SS 陰性血清進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗，經(jīng)計算結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)為2.87%～4.70%，批間變異系數(shù)為3.10%～7.20%。均小于10%（表4），表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.6 符合率試驗結(jié)果 分別采用玻片凝集方法和rMRP-ELISA方法同時檢測100份內(nèi)蒙古某動物疾病診斷中心臨床豬血清樣本。凝集試驗結(jié)果顯示，SS2、SS7、SS9、SS12 陽性血清均為陽性結(jié)果，而SS 陰性血清和空白對照的試驗結(jié)果均為陰性結(jié)果。玻片凝集試驗的陽性對照和陰性對照均成立。玻片凝集試驗的檢測結(jié)果顯示，從100 份臨床血清樣品中檢出29 份陽性血清，總檢出率為29%；而經(jīng)rMRP-ELISA方法檢測出陽性血清樣品34份，總檢出率為34%，二者總符合率為85.3%。

表4 rMRP-ELISA 方法的重復(fù)性試驗結(jié)果Table 4 Intra- and inter-batch repeatability test of rMRP-ELISA

2.7 間接ELISA 抗體檢測方法的應(yīng)用 利用本研究建立的rMRP-ELISA 方法對哈爾濱獸醫(yī)研究所動物衛(wèi)生檢測中心保存的來自東北三省部分地區(qū)豬場的240 份臨床豬血清以及寶士德生物科技有限公司送檢的200 份臨床豬血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，SS 陽性檢出率為27.7%（122/440）。表明，東北三省部分地區(qū)豬場SS 陽性率較高。

3 討 論

近幾年，關(guān)于豬鏈球菌病的ELISA 診斷方法多有報道，由于SS2 在SS 的所有血清型中致病性最強(qiáng)且分離率最高，大多數(shù)報道的均是基于SS2 的ELI?SA 檢測方法。張玲妮等利用SS2 9801 株以及該菌的莢膜多糖（CPS）提取物分別建立了兩種間接ELISA方法，對這兩種方法的比較結(jié)果顯示，利用CPS 包被的間接ELISA 方法雖然具有較強(qiáng)的特異性，但是靈敏性較低，同時對ELISA 板的要求較高；而利用全菌包被的間接ELISA 方法，雖然與前者相比特異性較差，但是通過該方法可以找到一個特異性和靈敏度均較高的血清抗體稀釋度，因此利用全菌包被的間接ELISA 方法更適合于SS2 血清抗體的檢測[18]。高地等建立了SS2 免疫磁珠夾心ELISA 檢測方法，結(jié)果表明該方法具有較好的特異性和敏感性。但該方法所用磁珠必須要求徹底的活化和淬滅，對磁珠要求較高。另外，在檢測過程中可能因為抗體純度不夠或者磁珠上的基團(tuán)易與二抗發(fā)生偶聯(lián)從而使陰性本底增高，同時磁珠包被抗體之后有效存放時間較短，因此不太適合商品化檢測要求[19]。周明光等利用SS2 菌株的CPS 作為包被抗原建立了檢測SS2 血清抗體的間接ELISA 方法，結(jié)果表明該方法具有操作簡單、特異性及靈敏度高等特點，適用于SS2 血清抗體的檢測及流行病學(xué)調(diào)查。利用該方法對來自北京、河南、廣東等地的3 991份臨床血清進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明各省臨床血清的陽性率在0～41.6%[20]。

本實驗建立的rMRP-ELISA 方法具有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，而且批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)均較低，表明該方法具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，并且一抗和二抗的孵育時間較短（30 min）。對送檢的440 份臨床血清樣品的陽性檢出率為27.7%，與上述周明光建立的間接ELISA 方法對臨床血清樣品的檢測結(jié)果相符。此外，除SS2 之外，其他幾種血清型如：SS7、SS9 以及SS12 等也是臨床上常見的致病菌，同樣危害著豬的健康。而本實驗建立的rM?RP-ELISA 方法對SS2、SS7、SS9 和SS12 陽性血清的檢測結(jié)果均為陽性，表明該方法同時適用于SS2、SS7、SS9 以及SS12 血清抗體的檢測。因此該間接ELISA 方法可以對SS 進(jìn)行更加廣泛的檢測，并且也為SS 病的流行病學(xué)調(diào)查提供了一種可靠的診斷方法。由于目前本實驗室除了SS2、SS7、SS9 以及SS12之外，暫時還沒有其它血清型的陽性血清，本實驗建立的rMRP-ELISA 方法是否適用于其它血清型SS血清抗體的檢測還需要后續(xù)試驗進(jìn)一步驗證。