A 型塞尼卡病毒與O 型、亞洲I 型、A 型口蹄疫病毒多重RT-PCR 檢測方法的建立

謝守玉，劉惠心，施開創(chuàng)*，趙 晶，屈素潔，尹彥文，王樹培，陸文俊，馮淑萍，粟艷瓊

（1.廣西動物疫病預防控制中心，廣西 南寧 530001；2.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005）

A 型塞尼卡病毒（Senecavirus A，SVA），曾用名塞尼卡谷病毒（SenacaVally virus，SVV），是小RNA病毒科塞尼卡病毒屬的唯一成員[1]。2002 年，首次在細胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)SVA，最初被認為是來源于豬胰蛋白酶或胎牛血清的污染物。直至2007 年，加拿大首次報道SVA 可導致豬發(fā)生原發(fā)性水皰?。≒or?cine idiopathic vesicular disease，PIVD）[2]。2012 年美國首次報道該病[3]，但SVA 在美國豬群的存在最早可追溯至1988 年[4]。隨后，巴西、中國、哥倫比亞、泰國、越南等國家相繼報道SVA 感染豬群發(fā)病[5-9]。在我國廣東省2015 年首次報道[6]之后相繼在湖北、黑龍江、福建及河南等多個省份暴發(fā)由SVA 感染引起的PIVD[10-12]。

SVA 能夠感染不同年齡段的豬[13]。成年豬感染初期表現(xiàn)為厭食、嗜睡及發(fā)熱等癥狀，隨后在吻部、口腔、舌面和蹄部產生水皰，繼而水皰破裂發(fā)生潰瘍，造成蹄殼脫落致使病豬跛行。SVA 發(fā)病率因不同生長階段的豬群而異，斷奶仔豬的發(fā)病率為0.5%～5%，育肥豬及后備豬的發(fā)病率為5%～30%，而新生仔豬的發(fā)病率可高達70%、死亡率可達15%～30%[14-15]。SVA 感染的臨床癥狀與豬口蹄疫（Footand-mouth disease，F(xiàn)MD）極為相似，難以區(qū)分，需要實驗室鑒別診斷。當前，國內外已有學者建立了針對SVA 和/或FMD 病毒（FMDV）的多重RT-PCR 鑒別檢測方法。張彥婷等、李金海等建立了O 型、A型及亞洲I 型FMDV 多重RT-PCR 檢測方法[16-17]，黃元等建立了小反芻獸疫病毒（PPRV）、A 型和O 型FMDV 多重RT-PCR 檢測方法[18]，劉濤等建立了SVA和FMDV 雙重RT-PCR 檢測方法[19]。然而，迄今尚未見能夠同時檢測并區(qū)分SVA 與O 型、亞洲I 型、A型FMDV 多重RT-PCR 的報道。本研究首次建立了鑒別檢測SVA 與O 型、亞洲I 型、A 型FMDV 的多重RT-PCR 方法，為快速鑒別檢測SVA 和FMDV 提供了有效的技術手段。

1 材料與方法

1.1 病毒株及臨床樣品 SVA 分離株（GD 株）由揚州大學惠贈；FMDV O 型疫苗株（OS 株）、亞洲I 型疫苗株（JSL 株）、A 型疫苗株（AF/72 株）購自中農威特公司。豬瘟病毒（CSFV）疫苗株（C 株）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）疫苗株（TJM-F92 株）、偽狂犬病病毒（PRV）疫苗株（Bartha-K61 株）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）疫苗株（SX07 株）、PCV3 分離株（GX18 株）、豬細小病毒（PPV）疫苗株（N 株）均由本實驗室保存。30 份疑似臨床樣品（每頭病豬包括淋巴結、水皰液、痂皮等）采集自2019 年廣西各地豬場疑似病豬。

1.2 主要試劑 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5.0、PrimeScriptⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit、TksGflexTMDNA Polymerase、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0、pMD18-T 載體、E. coliDH5α 感受態(tài)細胞、Mini Plasmid Kit、EcoR I 及Hind Ⅲ內切酶均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 引物設計 根據(jù)GenBank 登錄的SVA（NC_011349）、O 型FMDV（KR401154）、亞洲I 型FMDV（KR073010）及A 型FMDV（KT968663）參考株基因序列，設計特異性引物（表1），分別用于擴增SVA 3D基因以及O 型、亞洲I 型、A 型FMDV VP1 基因。

1.4 重組質粒標準品的制備 根據(jù)SVA 參考株（NC_011349）3D 基因序列，人工合成157 bp 目的基因片段，以其為模板，以SVA-F/SVA-R 引物，PCR擴增目的片段；取O 型、亞洲I 型、A 型FMDV 疫苗株病毒液200 μL，采用病毒核酸提取試劑盒分別提取總RNA，將其反轉錄為cDNA，分別作為模板，采用表1 中相應的特異性引物，PCR 擴增目的片段。使用膠回收試劑盒分別回收、純化PCR 產物，連接至pMD18-T 載體、轉化E. coliDH5α 感受態(tài)細胞，篩選陽性菌落并擴大培養(yǎng)后，抽提質粒，進行PCR、酶切及測序鑒定。鑒定正確的相應重組質粒作為標準品。測定4 種質粒標準品的濃度后，分別將其換算為拷貝數(shù)。

1.5 多重RT-PCR 反應條件的優(yōu)化 建立25 μL 反應體系：2×PremixTaqTM12.5 μL，4對特異性上、下游引物各0.5 μL，4 種重組質粒標準品等比例混合物2.5 μL，滅菌雙蒸水6 μL。采用方陣法對多重RTPCR 反應的退火溫度（53.0 ℃、53.2 ℃、53.6 ℃、54.2 ℃、54.9 ℃、55.6 ℃、56.4 ℃、57.1 ℃、57.8 ℃、58.4 ℃、58.8 ℃、59.0 ℃）、引物濃度（終濃度為0.20 pmol/μL、0.25 pmol/μL、0.30 pmol/μL、0.35 pmol/μL、0.40 pmol/μL、0.45 pmol/μL、0.50 pmol/μL、0.55 pmol/μL、0.60 pmol/μL）及循環(huán)數(shù)（25、30、35、40、45 個循環(huán)）等反應條件進行優(yōu)化。

表1 本研究所使用的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.6 特異性試驗 取SVA、FMDV（O 型、亞洲I型、A 型）、CSFV、PRRSV 及PEDV 病毒液，采用病毒核酸提取試劑盒分別抽提總RNA，反轉錄為cD?NA；取PRV、PPV、PCV2 及PCV3 病毒液，采用病毒核酸提取試劑盒抽提總DNA。分別以上述cDNA和DNA 為模板，以4 種重組質粒標準品混合物為陽性對照、滅菌雙蒸水為陰性對照，按照已優(yōu)化的多重RT-PCR 反應條件進行PCR 擴增，進行該方法的特異性試驗。

1.7 敏感性試驗 分別將重組質粒標準品pSVA-3D、pO-VP1、pAsia I-VP1 及pA-VP1 10 倍倍比稀釋成終濃度為2.5×108拷貝/μL～2.5×100拷貝/μL，進行單一PCR 擴增；將4種重組質粒標準品等比例混合后10倍倍比稀釋，使其終濃度均為2.5×108拷貝/μL～2.5×100拷貝/μL，按照已優(yōu)化的反應條件進行多重PCR 擴增，對比兩種方法的擴增結果，評估本實驗建立的多重RT-PCR 方法的敏感性。

1.8 重復性試驗 將4種重組質粒標準品等比例混合后10 倍倍比稀釋，使其終濃度均為2.5×107拷貝/μL，按照已優(yōu)化的反應條件經多重RT-PCR 擴增，進行重復性試驗。批內試驗，每個試驗重復5 次；批間試驗做5 次，每次間隔1 周。比較批內批間試驗檢測結果，評估本實驗建立的多重RT-PCR 方法的重復性。

1.9 多重RT-PCR 方法的臨床應用 取30 份臨床疑似樣品，用滅菌剪刀將臨床組織樣品剪至小塊狀，連同水皰液，放入含有適量（W/V，1 4）pH 7.2 PBS 溶液的滅菌離心管中，反復凍融3 次，研磨至糜狀后12 000×g 離心3 min，取200 μL 上清抽提總RNA，利用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA 作為模板。利用所建立的多重RT-PCR 方法檢測SVA 以及O 型、亞洲I 型、A 型FMDV。同時，按照國家標準《口蹄疫診斷技術》（GB/T18935-2003）中的RT-PCR方法分別對O型、亞洲I型、A型FMDV進行檢測，按照Feronato 等報道的SVA 套式RT-PCR 方法[20]對SVA進行檢測，比較兩種方法對相同病料樣品的檢測結果，計算二者的符合率。隨機選取其中3 份陽性樣品，回收PCR 產物、連接pMD-18T 載體、轉化DH5α 感受態(tài)細胞，陽性克隆增菌培養(yǎng)后提取質粒進行測序、比對。

2 結 果

2.1 重組質粒標準品的鑒定結果 以人工合成的SVA 目的片段，以及O 型、亞洲I 型、A 型FMDV 疫苗株的cDNA 為模板，利用特異性引物進行PCR 擴增，獲得SVA 157 bp 的3D 基因（圖1 A）、O 型FMDV 240 bp 的VP1 基因（圖1 B）、亞洲I 型FMDV 460 bp 的VP1 基因（圖1 C）及A 型FMDV 320 bp 的VP1 基因目的片段（圖1 D）。經回收PCR 產物后連接pMD18-T載體，轉化DH5α 感受態(tài)細胞，陽性克隆增菌培養(yǎng)后提取質粒。經PCR、酶切及測序鑒定正確后，獲得的重組質粒分別命名為pSVA-3D、pO-VP1、pA?sia I-VP1 及pA-VP1，作為質粒標準品。

圖1 重組質粒pSVA-3D（A）、pO-VP1（B）、pAsia I-VP1（C）及pA-VP1（D）的酶切鑒定結果Fig. 1 Identification of recombinant plasmids pSVA-3D(A),pO-VP1(B), pAsia I-VP1(C) and pA-VP1(D)

2.2 多重RT-PCR 方法各條件的優(yōu)化結果 經優(yōu)化退火溫度、引物濃度、反應循環(huán)數(shù)等反應條件，確立多重RT-PCR 反應的最佳退火溫度為58.4 ℃；SVA 及O 型、亞洲I 型、A 型FMDV 特異性上、下游引物最佳終濃度分別為0.3 pmol/μL、0.3 pmol/μL、0.25 pmol/μL、0.25 pmol/μL；最佳擴增循環(huán)數(shù)為40 個。以引物濃度為例的優(yōu)化結果見圖2。

建立25 μL 反應體系：2×PremixTaqTM12.5 μL，SVA、O 型FMDV 特異性上、下游引物（10 pmol/μL）各0.75 μL，亞 洲I 型、A 型FMDV 上、下 游 引 物（10 pmol/μL）各0.625 μL，模板2.5 μL，滅菌雙蒸水4.5 μL。PCR 擴 增 程 序：94 ℃3 min；94 ℃30 s，58.4 ℃30 s，72 ℃30 s，40個循環(huán)；72 ℃10 min。

2.3 特異性試驗結果 分別以重組質粒標準品pS?VA-3D、pO-VP1、pAsia I-VP1、pA-VP1 混合物，O型、亞洲I 型、A 型FMDV、SVA、CSFV、PRRSV、PEDV 的cDNA，以及PRV、PPV、PCV2、PCV3 的DNA 為模板，進行多重RT-PCR。結果顯示，僅4種重組質粒標準品混合物以及O 型、亞洲I 型、A型FMDV、SVA 的cDNA 擴增出目的條帶，其他病毒均未擴增出條帶（圖3），表明該多重RT-PCR 特異性較強。

圖2 多重RT-PCR 引物濃度的優(yōu)化結果Fig. 2 Optimization for primer concentrations of the multiplex RT-PCR

圖3 多重RT-PCR 特異性試驗結果Fig. 3 Specificity test of the multiplex RT-PCR

2.4 敏感性試驗結果 分別將重組質粒標準品pS?VA-3D、pO-VP1、pAsia I-VP1 及pA-VP1 10 倍倍比稀釋成終濃度為2.5×108拷貝/μL～2.5×100拷貝/μL，進行單一PCR 和多重RT-PCR 反應。結果顯示，單一PCR 檢測pSVA-3D、pO-VP1、pAsia I-VP1、pA-VP1重組質粒標準品的檢出下限均為2.5×101拷貝/μL（圖4A），多重RT-PCR 檢測這4 種重組質粒標準品的檢出下限均為2.5×102拷貝/μL（圖4B）。表明所建立的多重RT-PCR 的敏感性較高。

2.5 重復性試驗結果 隨機選取終濃度均為2.5×107拷貝/μL 的4 種重組質粒標準品混合物作為模板，以相同的條件進行多重PCR 的批內和批間重復性試驗，結果顯示，批內和批間重復性試驗均能擴增出均勻一致的目的條帶（圖5），表明該方法重復性較好。

圖5 多重RT-PCR 重復性試驗結果Fig. 5 Repeatability test of the multiplex RT-PCR

2.6 多重RT-PCR 方法的臨床應用結果 利用所建立的多重RT-PCR 方法，對30 份臨床疑似樣品進行檢測，結果顯示，SVA 陽性樣品5 份，陽性率為16.67%；O 型FMDV 陽性樣品19 份，陽性率為63.33%；未檢出亞洲I 型及A 型FMDV。部分臨床樣品檢測結果見圖6。同時，按照口蹄疫診斷技術國家標準中的RT-PCR 方法分別對O 型、亞洲I 型、A型FMDV 進行檢測，按照文獻報道的SVA 套式RTPCR 方法[20]對SVA 進行檢測，結果與本研究建立的多重RT-PCR 方法檢測結果的符合率為100%。對隨機選取的3 份陽性樣品PCR 產物進行測序比對，結果證實均為相應病毒的基因片段。表明本實驗建立的多重RT-PCR 方法可用于臨床檢測。

圖6 部分臨床樣品的檢測結果Fig. 6 Detection results of partial clinical samples by the multiplex RT-PCR

3 討 論

由于SVA 與FMDV 感染豬群的臨床癥狀、病理變化極為相似，臨床上難以區(qū)分，需借助實驗室檢測才能鑒別診斷[21-22]。多重RT-PCR 具有擴增效率高、速度快、成本低等優(yōu)點，尤其適合混合感染樣品中多種病原的鑒別檢測，因而廣泛應用于實驗室。多重RT-PCR 方法的突出優(yōu)點是特異性強、敏感性較高、擴增效率高、速度較快、成本低廉，并且通過一個反應即可檢測多個目的基因，尤其適合混合感染樣品中多種病原的鑒別檢測。因此，多重RT-PCR 方法仍是當前我國各級獸醫(yī)實驗室的一種理想選擇，因而得到普遍使用，在我國動物疫病的監(jiān)測、檢測、診斷和流行病學調查中發(fā)揮不可替代的作用。但是，多重RT-PCR 方法也有局限性，突出問題是多重RT-PCR 方法的敏感性一般會比相應的單一RT-PCR 的敏感性稍低，也比相應的多重熒光定量RT-PCR 方法敏感性低；同時由于需要經凝膠電泳后觀察結果，容易污染環(huán)境，導致假陽性出現(xiàn)。由于方法本身的局限性，部分病毒含量很低的樣品有可能會漏檢，部分陰性樣品也有出現(xiàn)假陽性的風險，這是利用該方法進行樣品檢測時需要注意防范的技術風險。隨著我國經濟發(fā)展和科技進步，熒光定量RT-PCR 將更加普及，不斷被基層獸醫(yī)實驗室推廣并應用。但當前國內外已報道的針對SVA和FMDV 的多重RT-PCR 檢測方法均不能同時檢測并區(qū)分SVA 及O 型、亞洲I 型、A 型FMDV。為此，本研究建立了鑒別檢測SVA 和O、A、亞洲I 型FM?DV 的多重熒光定量RT-PCR 方法，供有條件的實驗室選擇使用。

本研究針對SVA 3D 基因的保守區(qū)域，O 型、亞洲I 型、A 型FMDV VP1 基因的差異區(qū)域，分別設計特異性引物，優(yōu)化退火溫度、引物濃度、擴增循環(huán)數(shù)等反應條件，建立了SVA 與O 型、亞洲I 型、A 型FMDV 多重RT-PCR 檢測方法，實現(xiàn)了在同一個反應體系中同時鑒別檢測這些病原的目的。所建立的方法敏感性高，對各質粒標準品的最低檢出下限均達到2.5×102拷貝/μL；特異性較強，只能擴增SVA與O 型、亞洲I 型、A 型FMDV，而與其他主要豬源病毒均無交叉反應；重復性好，同一反應條件下均能擴增出均勻一致的目的條帶。

利用本研究所建立的方法對2019 年采集自廣西各地的30 份臨床疑似樣品進行檢測。結果顯示，SVA 檢出陽性率為16.67%（5/30），O 型FMDV 檢出陽性率為63.33%（19/30），未能檢出亞洲I 型及A 型FMDV（0/30）。張志等檢測來自遼寧、福建、廣西等12個省的臨床樣品，發(fā)現(xiàn)SVA 陽性檢出率在2016年～2018 年分別為14.6%、21.9%及22.6%[23]；劉健新等檢測來自廣東省的124 份臨床樣品，發(fā)現(xiàn)SVA 陽性檢出率為3.2%[24]；以上結果表明，我國豬群存在不同程度的SVA 感染，并且有不斷蔓延擴散之勢。目前我國主要以O 型FMDV 緬甸98 株流行為主[25]。而亞洲I 型和A 型FMD 也曾在我國暴發(fā)和流行。2005年后，山東、江蘇、新疆及河北等多地相繼暴發(fā)牛亞洲I 型FMD 疫情，同時也在病豬中分離和鑒定到亞洲I 型FMDV[26]。最近幾年，亞洲I 型FMD 防控在我國取得重大突破，2011 年6 月以來全國未檢出亞洲I 型FMDV 病原學陽性樣品，已達到全國免疫無疫標準，因此2018 年起亞洲I 型FMD 在我國退出免疫（農業(yè)農村部第2635 號公告）；但周邊一些國家仍時有亞洲I 型FMD 發(fā)生[27]，在云南采集來自境外流動動物的組織樣品中亞洲I 型FMDV 陽性檢出率高達5.83%（7/120）[28]，國外疫情存在重新傳入我國的巨大風險。而A 型FMD 于2013 年在我國茂名市的豬群中首次確認后，在全國迅速蔓延，A 型FMD 在我國豬FMD 疫情中的比例不斷攀升[29]，僅2013 年我國向OIE報告的A 型FMD 疫情就高達11 起。因此對O 型、亞洲I 型、A 型FMD 的監(jiān)測和防控仍然不能松懈。本研究針對SVA 與O 型、亞洲I 型、A 型FMDV，首次建立了同時檢測并區(qū)分上述病原的多重RT-PCR 方法，敏感性高、特異性強、重復性好，為臨床上上述病原的鑒別檢測及流行病學調查提供有效的技術方法，具有重大的現(xiàn)實意義和應用價值。