穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的HeLa 細(xì)胞系的建立

劉燕飛，那 雷，王曉鈞

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/馬傳染病和慢病毒病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江 哈爾濱 150069）

CRISPR（Clustered regularly interspersed short pal?indromic repeat）是大腸桿菌基因組存在的規(guī)律成簇的間隔短回文序列[1-2]。在CRISPR序列位點(diǎn)附近存在一類具有多態(tài)性的家族基因，其編碼的蛋白具有核酸酶活性，可與CRISPR 序列共同抵御外界噬菌體和外源基因的侵入。這些蛋白稱為CRISPR 相關(guān)蛋白（CRISPR associated，Cas），與CRISPR 序列組成的CRISPR-Cas 系統(tǒng)是細(xì)菌中重要的獲得性免疫系統(tǒng)[3]。

目前CRISPR-Cas 系統(tǒng)分為3 種類型，Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。CRISPR-Cas9 系統(tǒng)屬于Ⅱ型，與其它兩種類型相比，該系統(tǒng)只需要一個(gè)蛋白即Cas9 蛋白參與便可發(fā)揮其免疫功能，因此其機(jī)制研究得最為清楚，應(yīng)用也最為廣泛。當(dāng)外源基因二次侵入時(shí)，在CRISPR 序列上游前導(dǎo)基因的調(diào)控下轉(zhuǎn)錄出兩種產(chǎn)物反式激活crRNA（Transactivating CRISPR RNA，tracrRNA）和pre-crRNA（pre-CRISPR-derived RNA）。pre-crRNA 和tracrRNA 存在一段互補(bǔ)序列，形成雙鏈區(qū)域。隨后tracrRNA 指導(dǎo)RNase Ⅲ和Cas9 蛋白對(duì)pre-crRNA 剪切，形成成熟的crRNA-tracrRNA-Cas9復(fù)合體。該復(fù)合體在PAM（Protospacer adjacent motif）位點(diǎn)附近切割crRNA 互補(bǔ)的外源基因序列，從而保護(hù)機(jī)體免于受到病原的侵入[4-5]。研究者利用這一機(jī)制將crRNA 和tracrRNA 的關(guān)鍵基序融合成單一指導(dǎo)RNA（sgRNA），可引導(dǎo)Cas9 蛋白正確識(shí)別并切割特定序列，為后續(xù)CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)[6]。

近年來CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了其在多種細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)的基因編輯[7-8]。2014 年，首個(gè)覆蓋人類全基因組的CRISPR-Cas9 敲除文庫（GeCKO）構(gòu)建成功[9]。隨后多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)和實(shí)驗(yàn)室利用CRISPR-Cas9 敲除文庫（GeCKO）進(jìn)行大規(guī)模的遺傳篩選，比如利用功能性缺失型策略篩選參與人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency vi?rus，HIV）和甲型流感病毒（Influenza A virus，IAV）等病毒復(fù)制階段的宿主蛋白及介導(dǎo)未整合鼠白血病病毒（Murine leukemia virus，MLV）沉默的宿主蛋白[10-12]。篩選研究的第一步是將sgRNA 慢病毒文庫導(dǎo)入到表達(dá)Cas9 的細(xì)胞中，從而構(gòu)建全基因組沉默的敲除細(xì)胞文庫。因此，選擇敲除效率高的細(xì)胞系是保證獲得高覆蓋率敲除細(xì)胞文庫的關(guān)鍵。本研究利用慢病毒感染的方式，將Cas9 基因穩(wěn)定導(dǎo)入HeLa 細(xì)胞中，建立表達(dá)Cas9 蛋白的單克隆細(xì)胞株。再利用同時(shí)表達(dá)GFP 和GFP sgRNA 的慢病毒感染HeLa-Cas9 單克隆細(xì)胞系，經(jīng)嘌呤霉素培養(yǎng)液篩選一周后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞的百分比以鑒定HeLa-Cas9 單克隆細(xì)胞系的敲除效率[13]。最終篩選到一株高敲除活性且細(xì)胞活性無顯著變化的HeLa-Cas9 單克隆細(xì)胞系，為進(jìn)一步構(gòu)建基因敲除細(xì)胞文庫奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及質(zhì)粒 人胚胎腎細(xì)胞HEK293T 細(xì)胞和宮頸癌細(xì)胞系HeLa 細(xì)胞株、質(zhì)粒lentiCRISPR v2-Hyg（潮霉素抗性）、pMD2.G 和pSPAX2 均由本實(shí)驗(yàn)室保存；pXPR-011 質(zhì)粒（Addgene，貨號(hào)59702，該質(zhì)粒含GFP 和GFP sgRNA 序列）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所趙東明研究員惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑 質(zhì)粒提取試劑盒購自Invitrogen 公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自天根生化科技（北京）有限公司；磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑（140 mmol/L NaCl、1.5 mmol/L Na2HPO4·2H2O、50 mmol/L Hepes、pH=7.05）、細(xì)胞裂解液（50 mmol/L Hepes、50 mmol/L KCl、0.25% NP-40、1 mmol/L DTT、100 mmol/L Na?Cl、pH=7.9）由本實(shí)驗(yàn)室配置；胎牛血清購自Wi?sent 公司；潮霉素（Hygromycin B Gold）購自InvivoGen公司；兔抗Flag 多克隆抗體和鼠抗β-actin 單克隆抗體（MAb）購自Sigma 公司；紅外熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）和紅外熒光標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（H+L）IgG 購自KPL 公司；CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物生物技術(shù)有限公司。

1.3 穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的細(xì)胞系的構(gòu)建及鑒定

1.3.1 表達(dá)Cas9 蛋白慢病毒的制備 將3×106個(gè)HEK293T 細(xì)胞接種于10 cm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度達(dá)到30%～40%時(shí)，采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將2 μg pMD2.G、9 μg pSPAX2 和9 μg lentiCRISPR v2-Hyg 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞，8 h 后換液，48 h 后收獲上清，用0.45 μm 濾膜過濾細(xì)胞碎片，所得上清即為表達(dá)Cas9 蛋白的慢病毒原液，置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的HeLa 細(xì)胞系的建立將1.5×105個(gè)HeLa 細(xì)胞接種于6 孔板中，用1.5 mL 表達(dá)Cas9 蛋白的慢病毒原液感染細(xì)胞，8 h 后換液，培養(yǎng)至48 h，用潮霉素培養(yǎng)液篩選。為獲得最佳潮霉素工作濃度，潮霉素培養(yǎng)液的濃度分別為300 μg/mL、400 μg/mL 和500 μg/mL。每隔2 d 換液。待對(duì)照孔的細(xì)胞全部死亡后，收集存活細(xì)胞。利用western blot 鑒定Cas9 蛋白的表達(dá)。將這些細(xì)胞用流式分選系統(tǒng)分到96 孔板中，培養(yǎng)7 d 后選單克隆細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)2 周后，轉(zhuǎn)移至12 孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%，一半細(xì)胞用western blot 鑒定Cas9 的表達(dá)，另一半細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，待鑒定成功表達(dá)后，擴(kuò)大培養(yǎng)并置于液氮保存。將該單克隆細(xì)胞穩(wěn)定傳至20 代，western blot 檢測(cè)Cas9 蛋白表達(dá)，這些細(xì)胞株即為HeLa-Cas9 單克隆細(xì)胞系。

1.3.3 穩(wěn)定表達(dá)Cas9 多克隆細(xì)胞系和單克隆細(xì)胞系的鑒定 收集穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的細(xì)胞，以野生型HeLa 細(xì)胞為空白對(duì)照，用300 μL 蛋白裂解液裂解細(xì)胞，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂乳封閉2 h，以兔抗Flag（1 1 000）多克隆抗體為一抗，羊抗兔IgG（1 10 000）抗體為二抗，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)。

1.4 表達(dá)GFP和GFP sgRNA慢病毒的制備及病毒滴度的測(cè)定 將HEK293T 細(xì)胞按3×106個(gè)接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，16 h～18 h 后用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將2 μg pMD2.G、9 μg pSPAX2 和9 μg pXPR-011 3 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，8 h 換液，48 h 收集上清，用0.45 μm 的濾膜過濾細(xì)胞碎片，所得上清即為同時(shí)表達(dá)GFP 和GFP sgRNA 的 慢 病 毒 原 液， 置 于-80 ℃?zhèn)?用。 取1 mL HeLa 細(xì)胞（1×105個(gè)）與1 mL 同時(shí)表達(dá)GFP 和GFP sgRNA 慢病毒稀釋液（2 倍倍比稀釋：50 μL～800 μL）混合。慢病毒感染48 h 后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 清洗一遍，分別在每孔中加入300 μL 0.25%胰蛋白酶消化5 min，之后加入700 μL 培養(yǎng)液混勻后置于流式管中，利用流式細(xì)胞分析儀分析表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞的百分比，根據(jù)表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞的百分比為10%～20%的病毒稀釋液倍數(shù)計(jì)算病毒滴度。病毒滴度計(jì)算公式：病毒滴度（TU/mL）=（初始感染細(xì)胞數(shù)×GFP 細(xì)胞百分比）/（每孔感染病毒體積）×1 000。

1.5 穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的HeLa 單克隆細(xì)胞系中Cas9 敲除活性的檢測(cè) 將穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的HeLa 細(xì)胞系按1×105個(gè)/孔接種于6 孔板，感染MOI 0.4 同時(shí)表達(dá)GFP 和GFP sgRNA 的慢病毒。48 h 后，更換含1 μg/mL 嘌呤霉素的培養(yǎng)液，之后每2 d更換一次含1 μg/mL 嘌呤霉素培養(yǎng)液，同時(shí)觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。篩選一周后利用流式分析儀檢測(cè)表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞的百分比，計(jì)算敲除效率%KO=[GFPWT-GFPCas9]/GFPWT（WT：野生型HeLa細(xì)胞）。

1.6 穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的HeLa 單克隆細(xì)胞系的細(xì)胞活性檢測(cè) 用400 μg/mL 的潮霉素培養(yǎng)液培養(yǎng)HeLa-Cas9 單克隆細(xì)胞系7 d 后，以1×104個(gè)/孔接種于96 孔板中，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，每孔更換預(yù)混培養(yǎng)液（其中組成為：10 μL CCK-8 試劑和90 μL 含10% FBS DMEM 培養(yǎng)基），以加了相應(yīng)量培養(yǎng)液和CCK-8 溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照，2 h 后測(cè)定OD450nm值。

1.7 二次單克隆化的細(xì)胞敲除效率和細(xì)胞活性檢測(cè)經(jīng)方法1.4 和1.5 鑒定成功的HeLa-Cas9 第8 株單克隆細(xì)胞系用流式分選系統(tǒng)再次單克隆化。細(xì)胞經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后按照方法1.4 和1.5 對(duì)其進(jìn)行Cas9 敲除效率和細(xì)胞活性檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的細(xì)胞系 用lentiCRISPR v2-Hyg 慢病毒感染HeLa 細(xì)胞，利用濃度300 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL 的潮霉素培養(yǎng)液篩選10 d，400 μg/mL 和500 μg/mL 濃度的對(duì)照細(xì)胞全部死亡。最終選定400 μg/mL 的潮霉素為篩選濃度培養(yǎng)多克隆細(xì)胞。Western blot 鑒定Cas9 蛋白表達(dá)后，經(jīng)傳至20 代，再次鑒定Cas9 蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示HeLa-Cas9 細(xì)胞系在158 ku 出現(xiàn)目的條帶，表明Cas9 蛋白在HeLa 細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)（圖1A）。上述多克隆細(xì)胞經(jīng)流式分選得到16 株?duì)顟B(tài)良好的單克隆，鑒定結(jié)果顯示其中有9 株細(xì)胞通過western blot 可檢測(cè)到明顯的Cas9 蛋白表達(dá)條帶，細(xì)胞序號(hào)分別是2、3、5、7、8、10、11、12 和13，而其余7 株均未檢測(cè)到Cas9蛋白的表達(dá)（圖1B），檢測(cè)正確表達(dá)Cas9 的細(xì)胞穩(wěn)定傳代20 代，仍能檢測(cè)到Cas9 蛋白的表達(dá)（圖略），表明穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的HeLa單克隆細(xì)胞系構(gòu)建正確。

2.2 慢病毒滴度的測(cè)定結(jié)果 利用稀釋的慢病毒感染1×105個(gè)HeLa 細(xì)胞。在病毒感染48 h 時(shí)，以未感染病毒的野生型HeLa 為陰性對(duì)照，利用流式分析儀分析HeLa 細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞數(shù)（圖2A），根據(jù)表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞百分比和感染病毒劑量繪制曲線，結(jié)果顯示表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞百分比在40%以下時(shí)，感染率與病毒感染劑量呈線性相關(guān)（圖2B），表明該病毒劑量下（MOI 0.4），一個(gè)病毒顆粒只感染一個(gè)細(xì)胞。本研究選取病毒量為50 μL時(shí)，計(jì)算可得病毒滴度為：（1×105×18.1%）/50 μL×1 000=3.62×105TU/mL 即每毫升病毒液中含有3.62×105個(gè)具有生物活性的病毒粒子。

2.3 建立的HeLa 單克隆細(xì)胞系的Cas9 活性 利用MOI 0.4同時(shí)表達(dá)GFP和GFP sgRNA的慢病毒，感染1×105個(gè)HeLa-Cas9 單克隆細(xì)胞系，2 d 后再用嘌呤篩選一周，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞百分比，計(jì)算HeLa-Cas9 單克隆細(xì)胞系的敲除效率，結(jié)果顯示除了第2 株細(xì)胞以外，其余8 株細(xì)胞的敲除效率均在50%以上，其中第8 株和第10 株細(xì)胞敲除效率最高，分別為79%和81%（表1），并將這兩株細(xì)胞記為HeLa-Cas9_8 和HeLa-Cas9_10。倒置熒光顯微鏡觀察HeLa 細(xì)胞的綠色熒光蛋白變化，結(jié)果顯示嘌呤霉素篩選至第6 d時(shí)，野生型HeLa 細(xì)胞中GFP蛋白表達(dá)最多（圖3A），此時(shí)HeLa-Cas9_8細(xì)胞中GFP蛋白表達(dá)很少（圖3B），表明HeLa-Cas9_8細(xì)胞中Cas9蛋白與GFP sgRNA結(jié)合靶向GFP基因。

圖1 Cas9 蛋白在HeLa 細(xì)胞中表達(dá)的western blot 鑒定Fig. 1 Identification of Cas9 protein expressed in HeLa cells by western blot

圖2 表達(dá)GFP 蛋白的細(xì)胞百分比的流式細(xì)胞術(shù)鑒定Fig. 2 Detection of the percentage of HeLa cells expressing green fluorescent protein by flow cytometry

表1 HeLa-Cas9 細(xì)胞敲除效率結(jié)果Table 1 Knockout efficiency of HeLa-Cas9 polyclonal cells

圖3 pXPR-011 慢病毒感染細(xì)胞HeLa/HeLa-Cas9_8 后GFP 表達(dá)情況Fig. 3 GFP expression in HeLa/HeLa-Cas9_8 cells infected with pXPR-011 lentiviral particles

2.4 穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白的HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞活性將野生型HeLa、HeLa-Cas9_8 和HeLa-Cas9_10 細(xì)胞系按照1×104個(gè)細(xì)胞鋪于96 孔板，24 h 后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后在酶標(biāo)儀下測(cè)OD450nm值，結(jié)果顯示HeLa-Cas9_8 的細(xì)胞活性與野生型HeLa 相比無差異，HeLa-Cas9_10 的細(xì)胞活性與野生型HeLa 相比差異顯著（圖4），表明穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白對(duì)HeLa 細(xì)胞的活性無影響。

2.5 HeLa-Cas9 單克隆細(xì)胞系二次單克隆化的細(xì)胞敲除效率和細(xì)胞活性 將HeLa-Cas9_8 細(xì)胞用流式分選系統(tǒng)再次單克隆化，獲得9 株單克隆細(xì)胞，兩周后經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)后按照方法1.4 和1.5 對(duì)其進(jìn)行Cas9 敲除效率和細(xì)胞活性檢測(cè)。結(jié)果顯示其中第6株細(xì)胞的敲除效率最高為87%（表2），表明二次分選后，表達(dá)Cas9 蛋白單克隆細(xì)胞之間敲除效率無明顯差異。HeLa-Cas9_8-6 細(xì)胞活性與野生型HeLa 細(xì)胞相比差異不顯著（圖5），表明穩(wěn)定表達(dá)Cas9 蛋白對(duì)HeLa 細(xì)胞的活性無影響，HeLa-Cas9_8-6 可作為構(gòu)建敲除文庫的候選細(xì)胞系。

圖4 表達(dá)Cas9 蛋白對(duì)細(xì)胞活性影響的檢測(cè)結(jié)果Fig. 4 Detection results of the effect with overexpression of Cas9 protein on cell viability western blot

表2 HeLa-Cas9_8 單克隆細(xì)胞系敲除效率結(jié)果Table 2 Knockout efficiency with HeLa-Cas9_8 monoclonal cells

圖5 表達(dá)Cas9 蛋白對(duì)細(xì)胞活性影響的檢測(cè)結(jié)果Fig. 5 Detection results of the effect of overexpression of Cas9 protein on cell viability

3 討 論

21 世紀(jì)初人們成功完成人類全基因組測(cè)序，為人類疾病相關(guān)研究提供了重要信息。為了鑒定某種或多種基因在疾病中發(fā)揮的功能，最直觀的方法是破壞基因的正常表達(dá)并分析其表型[14]。目前，人們可通過RNAi 全基因組篩選，單倍體細(xì)胞篩選和CRISPR/Cas9 全基因組篩選這3 種方法實(shí)現(xiàn)篩選影響特定表型的未知基因。其中CRISPR-Cas 系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是在基因組中進(jìn)行編輯，既不會(huì)出現(xiàn)RNAi 篩選中脫靶導(dǎo)致的假陽性率和未能完全抑制基因表達(dá)而產(chǎn)生的假陰性率，也不受到單倍體細(xì)胞篩選技術(shù)的細(xì)胞嚴(yán)苛限制。CRISPR-Cas9 屬于CRISPR-Cas 系統(tǒng)的第Ⅱ類編輯系統(tǒng)，即只需要Cas9 蛋白和sgRNA 便可完成基因靶向編輯，因此得到廣泛應(yīng)用。CRISPR 基因編輯技術(shù)由于其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便和基因編輯效率高等優(yōu)點(diǎn)已用于包括病毒、腫瘤等多種研究中。研究人員改良并構(gòu)建了可以產(chǎn)生更高滴度的病毒載體、單載體系統(tǒng)（lentiCRISPR v2、Cas9 和sgRNA 在一個(gè)載體中）和雙載體系統(tǒng)（Cas9 和sgRNA分別在兩個(gè)載體中）。單載體系統(tǒng)和雙載體系統(tǒng)包裝慢病毒的病毒滴度均比lentiCRISPR v1 高，其中雙載體系統(tǒng)的病毒產(chǎn)量要高出近100 倍[15]。單載體可能適用于原代細(xì)胞篩選或者活體實(shí)驗(yàn)，而雙載體可以用于各種體外細(xì)胞系。本研究利用雙載體系統(tǒng)首先構(gòu)建了表達(dá)Cas9 的HeLa 細(xì)胞系，通過篩選高敲除效率的細(xì)胞系，保證后續(xù)導(dǎo)入單條sgRNA 或GeCKO 文庫的敲除效果。

本研究意在建立穩(wěn)定表達(dá)Cas9 的HeLa 細(xì)胞系，利用GeCKO 雙載體文庫建立敲除細(xì)胞文庫。為保證后續(xù)構(gòu)建細(xì)胞文庫的高覆蓋率及良好均一性，篩選遺傳背景一致的高切割效率的HeLa-Cas9 單克隆細(xì)胞系至關(guān)重要。為保證單克隆細(xì)胞株嚴(yán)格來源于一個(gè)細(xì)胞克隆，本研究利用流式分選每個(gè)孔一個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)7 d 后鏡下觀察確定單克隆株。本實(shí)驗(yàn)共分選了16 株單克隆細(xì)胞株，但有個(gè)別細(xì)胞沒有檢測(cè)到Cas9 蛋白的表達(dá)[16]。因此，本研究選擇了9 株有明顯條帶的細(xì)胞株進(jìn)行了敲除效率的測(cè)定。本研究在測(cè)定Cas9 敲除效率時(shí)，以MOI 0.4 同時(shí)表達(dá)GFP 和GFP sgRNA 的慢病毒接種細(xì)胞，通過熒光觀察和流式檢測(cè)，結(jié)果顯示HeLa-Cas9_8 和HeLa-Cas9_10 的敲除效率在抗性篩選第7 d 時(shí)達(dá)到80%左右。雖然HeLa-Cas9_2 中Cas9 表達(dá)很好，但切割效率卻未達(dá)到50%，推測(cè)很有可能與插入的位點(diǎn)有關(guān)。本研究通過CCK-8 檢測(cè)HeLa-Cas9_8 和HeLa-Cas9_10 的細(xì)胞活性，結(jié)果顯示與野生型HeLa 細(xì)胞相比，HeLa-Cas9_10 細(xì)胞活性顯著提高，HeLa-Cas9_8 與野生型HeLa 細(xì)胞無顯著差別。因此，本研究選擇HeLa-Cas9_8 為建立文庫的候選細(xì)胞株。為嚴(yán)格保證細(xì)胞株的遺傳背景一致，本研究又將HeLa-Cas9_8 進(jìn)行了一次單克隆化，獲得HeLa-Cas9_8-6細(xì)胞株為最終細(xì)胞株。進(jìn)一步通過第二次克隆獲得的細(xì)胞株的敲除效率與HeLa-Cas9_8 相比并無顯著差異，表明經(jīng)過單輪的流式分選技術(shù)便可達(dá)到單克隆的目的。本研究獲得了一株高敲除效率HeLa-Cas9 單克隆細(xì)胞系，該細(xì)胞系可用于CRISPR 敲除文庫的轉(zhuǎn)導(dǎo)及篩選，為進(jìn)一步開展HIV-1 等病毒相關(guān)宿主基因的篩選及功能鑒定研究奠定基礎(chǔ)。