腸小體感染豬傳染性胃腸炎病毒模型的建立

尹靈丹，張 鑫，薛 美，李 亮，郭珊珊，羅 毅，馮 力，劉平黃

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteri?tis virus，TGEV）是一種有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，病毒基因組大小約28.5 kb[1]。TGEV 感染主要引起新生仔豬腹瀉，對(duì)兩周齡以下仔豬的致死率高達(dá)100%[2]，臨床感染主要表現(xiàn)為嘔吐，嚴(yán)重腹瀉、脫水等急性腸炎癥狀[3]，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

腸上皮是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，主要由隱窩區(qū)和絨毛區(qū)兩個(gè)區(qū)域構(gòu)成，包含多種腸上皮細(xì)胞類(lèi)型（腸細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、潘氏細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞和簇絨細(xì)胞）[4]，是TGEV 感染的主要部位。目前對(duì)TGEV的基礎(chǔ)研究主要利用豬睪丸細(xì)胞（Swine testicular，ST）、豬腎細(xì)胞（Porcine kidney-15 cells，PK-15）和豬空腸上皮細(xì)胞（Porcine small intestinal epithelial cell line-jejunum，IPEC-J2）進(jìn)行。然而，ST 細(xì)胞和PK-15 細(xì)胞并非來(lái)源于豬腸上皮，并不能準(zhǔn)確反映腸上皮的生理特性；IPEC-J2 細(xì)胞，是一種來(lái)自仔豬的非轉(zhuǎn)化空腸上皮細(xì)胞系[5]，雖具有某些腸上皮的特性，但缺乏腸上皮復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)和多樣化的細(xì)胞類(lèi)型，因此極大地限制了TGEV 感染與宿主腸上皮之間相互作用的研究。

隨著干細(xì)胞技術(shù)的快速發(fā)展，Sato 等建立了能模擬體內(nèi)腸上皮復(fù)雜生理結(jié)構(gòu)的細(xì)胞模型—腸小體（Enteroids）[6]。腸小體不僅可在體外長(zhǎng)期、穩(wěn)定的培養(yǎng)，還能形成隱窩-絨毛樣區(qū)域的結(jié)構(gòu)，并且包含分化成熟的各種腸上皮細(xì)胞類(lèi)型，同時(shí)還能保留宿主的遺傳特性[7]，因此，腸小體比傳統(tǒng)的傳代細(xì)胞更具優(yōu)勢(shì)。目前，腸小體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于許多腸道病原的基礎(chǔ)研究，比如應(yīng)用于人的諾如病毒[8]，輪狀病毒[9]，腺病毒[10]等致病機(jī)制的研究，并取得了突破性進(jìn)展。參考Sato 等報(bào)道的腸小體培養(yǎng)方法[6]，本實(shí)驗(yàn)室建立了豬腸小體模型，并應(yīng)用于豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）的相關(guān)研究[11]，但豬腸小體是否可以作為T(mén)GEV 的感染模型目前尚不清楚。

為探究TGEV 是否可以感染豬腸小體，本研究從2 日齡仔豬的回腸組織分離培養(yǎng)了腸小體，并進(jìn)行TGEV 感染實(shí)驗(yàn)，為T(mén)GEV 基礎(chǔ)研究提供了一個(gè)良好的體外細(xì)胞模型，同時(shí)為闡明TGEV 與宿主腸上皮之間相互作用的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 TGEV AHHF 株（KX499468.1）由本實(shí)驗(yàn)室保存。2 日齡SPF 豬購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)中關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的所有方案均符合哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)準(zhǔn)則。

細(xì)胞培養(yǎng)成分F12 DMEM、胎牛血清（FBS）、0.25%Trypsin-EDTA 購(gòu)自Gibco 公司；腸小體培養(yǎng)液、溫和細(xì)胞解離試劑購(gòu)自Stem cell 公司；基質(zhì)膠Matri?gel?、脫脂乳購(gòu)自BD Biosciences 公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自BioFroxx 公司；細(xì)胞總RNA 提取試劑盒購(gòu)自博日公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；熒光定量試劑盒購(gòu)自Roche 公司；DAPI、Triton X-100購(gòu)自Sigma 公司；TGEV N 蛋白單克隆抗體（MAb）由本實(shí)驗(yàn)室制備保存[12]；抗Lgr5 抗體購(gòu)自Novus Biologi?cals 公司；抗villin 抗體、mucin2 抗 體、Ki-67 抗體購(gòu)自Abcam公司；Alexa Fluor 488驢抗兔IgG和Alexa Flu?or 546 山羊抗鼠IgG 購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 豬3D 腸小體的分離培養(yǎng)及2D 腸小體的培養(yǎng)參考Sato 及本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的培養(yǎng)方法[6,11]，從仔豬的回腸組織分離培養(yǎng)豬3D 回腸小體。當(dāng)腸小體細(xì)胞長(zhǎng)至第7 d 分化形成具有隱窩-絨毛樣結(jié)構(gòu)的3D 狀態(tài)后，用0.25% Trypsin-EDTA 消化成單細(xì)胞后以50個(gè)/孔加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)2 d～3 d 即可形成單層的腸小體。

1.3 不同劑量TGEV 感染腸小體的熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè) 當(dāng)2D 的回腸小體密度長(zhǎng)至90%左右時(shí)分別采用MOI 1、0.1 和0.01 TGEV 感染細(xì)胞，對(duì)照組加入等體積的F12 DMEM，37 ℃吸附2 h 后，F(xiàn)12 DMEM 洗滌細(xì)胞3 次，然后加入腸小體培養(yǎng)液于37 ℃培養(yǎng)，分別于感染后2 h 和24 h 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照本實(shí)驗(yàn)室以前報(bào)道的qPCR方法檢測(cè)TGEV的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平[13]。

1.4 TGEV 感染腸小體的病毒復(fù)制曲線測(cè)定 當(dāng)2D的回腸小體密度長(zhǎng)至90%左右時(shí)利用MOI 1 TGEV 感染細(xì)胞，并設(shè)立細(xì)胞對(duì)照，37 ℃吸附2 h 后，用F12 DMEM 洗滌細(xì)胞3 次后加入腸小體培養(yǎng)液，分別于感染后2 h、12 h、24 h、36 h 和48 h 收集細(xì)胞，同1.3 方法檢測(cè)TGEV 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。

1.5 TGEV 感染腸小體的間接免疫熒光（IFA）檢測(cè) 用MOI 1 TGEV 感染2D 的回腸小體，感染24 h后棄掉細(xì)胞上清液，經(jīng)PBS 洗滌細(xì)胞3 次后，用4%的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，經(jīng)0.2% Triton X-100 通透15 min，5%的脫脂乳在37 ℃封閉2 h 后，用抗TGEV N 蛋白MAb（1 1 000）為一抗，以Alexa Fluor 546 山羊抗鼠IgG（1 500）為二抗，DAPI 染色10 min 后，利用IFA 檢測(cè)TGEV N 蛋白 的表達(dá)[12]。

1.6 TGEV 感染腸上皮細(xì)胞類(lèi)型的雙熒光標(biāo)記IFA檢測(cè) 為探究TGEV 感染腸上皮細(xì)胞的類(lèi)型，本研究采用MOI 1 TGEV 感染2D 的回腸小體，感染24 h后棄掉細(xì)胞上清，經(jīng)PBS 洗滌細(xì)胞3 次后，用4%的多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，經(jīng)0.2% Triton X-100 通透15 min，5%的脫脂乳37 ℃封閉2 h 后，分別以檢測(cè)腸細(xì)胞的抗villin 多抗（1 100）、檢測(cè)干細(xì)胞的抗Lgr5 多抗（1 50）、檢測(cè)杯狀細(xì)胞的抗Mucin2多抗（1 50）、檢測(cè)增殖細(xì)胞的抗Ki-67 多抗（1 600）和檢測(cè)TGEV N 蛋白的MAb（1 1 000）為一抗，分別以Alexa Fluor 488 驢抗兔IgG（1 1 000）和Alexa Fluor 546 山羊抗鼠IgG（1 500）為二抗，DAPI 染色后利用IFA 檢測(cè)TGEV 感染的腸上皮細(xì)胞類(lèi)型。

1.7 TGEV 感染腸小體誘導(dǎo)IFN 產(chǎn)生的qPCR 檢測(cè) 已有研究表明TGEV 感染能夠激發(fā)天然免疫應(yīng)答并誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的干擾素[14-15]。為探究腸小體是否可作為一個(gè)良好的體外模型研究TGEV 感染的天然免疫應(yīng)答，本研究培養(yǎng)2D 回腸小體密度長(zhǎng)至90%左右時(shí)分別用MOI 1、0.1 和0.01 TGEV 感染細(xì)胞，并設(shè)立細(xì)胞對(duì)照，37 ℃吸附2 h 后，用F12 DMEM 洗滌細(xì)胞3次，加入腸小體培養(yǎng)液在37 ℃培養(yǎng)，分別于感染后2 h 和24 h 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的qPCR 方法檢測(cè)TGEV感染后IFN-β和IFN-L1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平[11,13]。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 所有數(shù)據(jù)均采用數(shù)據(jù)均值±標(biāo)準(zhǔn)平均誤差（SEM）計(jì)算，來(lái)自3～4 個(gè)獨(dú)立的平行實(shí)驗(yàn)，并且使用GraphPad Prism 7.0 進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)意義采用t 檢驗(yàn)。*：p<0.05 為 差異顯著，**：p<0.01 為差異顯著，***：p<0.001，****：p<0.0001為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 豬腸小體的分離與培養(yǎng) 參考Sato 及本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的腸小體培養(yǎng)方法[6,11]，從仔豬的回腸分離腸隱窩干細(xì)胞，并在含有基質(zhì)膠Matrigel 和腸小體培養(yǎng)液中培養(yǎng)，3 d 后觀察可見(jiàn)，腸道干細(xì)胞增殖并分化，形成具有囊腔樣的球狀體結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)7 d 后，萌芽形成含有隱窩-絨毛樣結(jié)構(gòu)的3D 回腸小體（圖1）。由于TGEV 感染的腸上皮頂端部分主要位于3D 腸小體內(nèi)部結(jié)構(gòu)區(qū)域，所以3D 的腸小體不適于進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)。有研究表明，解離3D 的鼠腸小體可以鋪成2D 腸小體單層細(xì)胞，且其具有適當(dāng)?shù)捻敹撕突讟O性，該結(jié)果極大地概括了3D 腸小體和體內(nèi)腸上皮的許多特性[16]。因此，本研究將3D 腸小體鋪成2D 的腸小體單層細(xì)胞用于TGEV 感染的研究。

圖1 豬腸小體的分離與培養(yǎng)Fig. 1 The isolation and culture of porcine enteroids

2.2 TGEV感染腸小體的病毒復(fù)制檢測(cè)結(jié)果 將不同劑量的TGEV 感染2D 回腸小體，在感染后24 h（hpi）收集細(xì)胞，通過(guò)qPCR 檢測(cè)病毒的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，與2 hpi相比，各組24 hpi病毒的mRNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著增加，且呈劑量依賴(lài)性（圖2A）。

采用MOI 1 TGEV 感染2D 回腸小體檢測(cè)并繪制病毒復(fù)制曲線。qPCR 結(jié)果顯示，與2 hpi 相比，在12 hpi 病毒的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平增加了321 倍，在24 hpi 病毒復(fù)制達(dá)到峰值（圖2B）。

將MOI 1 TGEV 感染2D 回腸小體，在24 hpi 通過(guò)IFA 檢測(cè)TGEV N 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，TGEV 感染回腸小體能檢測(cè)到較多N 蛋白表達(dá)的熒光，與上述mRNA 檢測(cè)結(jié)果相符（圖2C）。

以上結(jié)果表明，腸小體能夠支持TGEV 進(jìn)行有效地復(fù)制。

圖2 TGEV 感染腸小體的病毒復(fù)制檢測(cè)結(jié)果Fig. 2 Detection of the replication of TGEV in enteroids

2.3 雙熒光標(biāo)記IFA 檢測(cè)TGEV 感染腸上皮細(xì)胞類(lèi)型的結(jié)果 將MOI 1 TGEV 感染2D 回腸小體，在24 hpi 固定細(xì)胞，通過(guò)雙熒光標(biāo)記IFA 方法檢測(cè)TGEV 感染腸上皮細(xì)胞類(lèi)型。結(jié)果顯示，在表達(dá)vil?lin 的腸細(xì)胞檢測(cè)到TGEV N 蛋白的表達(dá)。此外，TGEV N 蛋白與干細(xì)胞的標(biāo)志物L(fēng)gr5、杯狀細(xì)胞的標(biāo)志物Mucin2 以及增殖細(xì)胞的標(biāo)志物Ki-67 存在共定位現(xiàn)象（圖3）。該結(jié)果表明TGEV 可感染多種腸上皮細(xì)胞類(lèi)型，包括腸細(xì)胞、干細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。

圖3 雙熒光標(biāo)記IFA 檢測(cè)TGEV 感染的腸上皮細(xì)胞類(lèi)型Fig.3 Detection of TGEV in intestinal epithelial types by double immunofluorescent labeling

2.4 TGEV 感染腸小體誘導(dǎo)IFN 產(chǎn)生的檢測(cè)結(jié)果用不同劑量的TGEV 感染2D 的回腸小體，在2 hpi 和24 hpi 收集細(xì)胞，通過(guò)qPCR 檢測(cè)Ⅰ型IFN（IFN-β）和Ⅲ型IFN（IFN-L1）的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，在24 hpi TGEV 感染顯著上調(diào)腸小體中IFN-β 和IFN-L1的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，且呈劑量依賴(lài)性（圖4A 和4B）。該結(jié)果表明TGEV 感染腸小體能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生先天免疫應(yīng)答，提示腸小體可以作為研究TGEV 感染對(duì)宿主先天免疫應(yīng)答影響的良好細(xì)胞模型。

3 討 論

TGEV 主要感染豬小腸絨毛上皮細(xì)胞，目前，用于TGEV 體外研究的細(xì)胞模型并不能模擬體內(nèi)腸上皮復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)和多樣化的細(xì)胞類(lèi)型，因此并不能準(zhǔn)確客觀地反映出TGEV 體內(nèi)感染的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。腸小體模型的建立，使在體外培養(yǎng)能重現(xiàn)體內(nèi)腸上皮生理特性的細(xì)胞模型成為現(xiàn)實(shí)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)細(xì)胞模型的不足，為體外研究腸道病原提供了一個(gè)全新的平臺(tái)。

本研究從仔豬的回腸組織分離腸隱窩干細(xì)胞來(lái)源的腸小體，建立TGEV 的腸小體感染模型。研究結(jié)果顯示，腸小體能夠支持TGEV 進(jìn)行有效地復(fù)制，表明腸小體可作為T(mén)GEV 感染的良好體外細(xì)胞模型，將有助于深入探究TGEV 的分子生物學(xué)特性。腸小體模型包含體內(nèi)多種腸上皮細(xì)胞類(lèi)型[6,11]，利用腸小體這一優(yōu)勢(shì)，本研究通過(guò)雙熒光標(biāo)記IFA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TGEV 能夠感染杯狀細(xì)胞，這與已有研究報(bào)道TGEV 體內(nèi)感染能以唾液酸依賴(lài)的方式與杯狀細(xì)胞相互作用的現(xiàn)象相符[17]，表明腸小體能模擬TGEV 體內(nèi)感染的情況。Jung 等人研究表明干細(xì)胞的數(shù)量和增殖可能與PEDV 感染的易感性相關(guān)[18]，盡管本研究發(fā)現(xiàn)TGEV 也能感染大量的干細(xì)胞，但這是否能夠影響其易感性還需深入探究。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)TGEV 也可以感染腸細(xì)胞、增殖細(xì)胞等多種腸上皮細(xì)胞類(lèi)型，表明TGEV 感染具有多種細(xì)胞嗜性。不同的腸上皮細(xì)胞類(lèi)型具有不同的生理作用[19]，TGEV 感染不同的腸上皮細(xì)胞類(lèi)型是否與病毒的致病性相關(guān)仍需進(jìn)一步探究，而腸小體為將來(lái)探索這一問(wèn)題提供了理想的體外模型。

圖4 TGEV 感染腸小體對(duì)IFN 表達(dá)的影響Fig.4 Effect of TGEV in enteroids on IFN expression

此外，本研究發(fā)現(xiàn)TGEV 感染腸小體能夠顯著誘導(dǎo)Ⅰ型IFN（IFN-β）和Ⅲ型IFN（IFN-L1）的產(chǎn)生，表明腸小體在TGEV 感染時(shí)能產(chǎn)生抗病毒免疫應(yīng)答，為將來(lái)研究TGEV 感染與宿主天然免疫應(yīng)答相互作用的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。有研究報(bào)道盡管TGEV 感染后能誘導(dǎo)大量?jī)?nèi)源性IFN 產(chǎn)生，但TGEV 仍能進(jìn)行有效復(fù)制[14-15]，提示TGEV 可能利用了一些潛在的機(jī)制來(lái)逃逸IFN 誘導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)，但I(xiàn)FN 是否能抑制TGEV 在腸小體中的復(fù)制仍需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，腸小體可作為T(mén)GEV 致病機(jī)制研究的良好模型，為進(jìn)一步闡明TGEV 與宿主腸上皮之間相互作用的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。