鼠傷寒沙門氏菌雙組分系統arcB 基因缺失株的構建及藥物敏感性分析

武珊珊，敬文憲，陳啟偉，李學瑞，劉永生

（中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730046）

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）是引起人和動物感染的重要食源性致病菌[1]，宿主廣泛，主要寄生于腸道，能引起各種畜禽發(fā)生急性/慢性或隱性感染。近些年，由于抗生素廣泛及長期使用，使該菌耐藥性嚴重增加，已成為嚴重威脅人類健康及食品安全的公共衛(wèi)生問題[2]。

雙組分系統是一種信號轉導途徑，普遍存在于原核生物和真核生物中，在細菌適應環(huán)境變化中起著重要作用，是其適應外界刺激的一種機制[3]。該系統與細菌的致病性、耐藥性、群體感應、生物被膜形成、毒力因子表達等多種生物學功能密切相關。Arc 雙組分系統是一種復雜的信號轉導系統，研究表明其在細菌能量代謝的調節(jié)中起著重要作用[4]。該系統由組氨酸激酶ArcB 和同源響應調節(jié)因子ArcA 組成。其中，ArcB 是一種三聯膜相關傳感器激酶，包含3 個細胞質結構域，一個具有保守His292殘基的末端發(fā)射結構域（H1），一個具有保守Asp576殘基的中心接收結構域（D1）和一個C 末端替代蛋白具有保守His717殘基的發(fā)送器結構域（H2）[5]。在缺氧環(huán)境刺激下，傳感器激酶ArcB 消耗ATP 經過His292→Asp576→His717途徑發(fā)生自身磷酸化，磷酸化的ArcB 在Asp54處催化ArcA 的轉磷酸化，從而抑制與有氧代謝有關基因的轉錄，并激活與厭氧代謝相關基因的轉錄[4-6]。而在有氧條下，ArcB 發(fā)揮磷酸酶的功能，催化ArcA 的去磷酸化，從而阻斷其相應的轉錄調控作用[7]。該系統調節(jié)鼠傷寒沙門氏菌的細胞代謝、生物合成和運動性[8]。之前多以研究arcB基因的結構以及Arc 雙組分系統在呼吸及能量代謝中的正反饋或負反饋作用為主，但該系統在鼠傷寒沙門氏菌耐藥性方面的作用還未見相關報道。因此，本實驗通過構建Arc 系統組氨酸激酶基因arcB缺失株，研究該基因對鼠傷寒沙門氏菌生長特性及藥物敏感性等的作用，初步探究Arc 系統對鼠傷寒沙門氏菌耐藥性的影響，為深入研究該系統對該菌的耐藥機制提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 鼠傷寒沙門氏菌CVCC541，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸桿菌Trans-T1 感受態(tài)細胞購自Transgen Biotech 公司；溫度敏感型質粒pKD46、pCP20、pKD4 由李干武老師惠贈；質粒pSTV28 購自TaKaRa 公司。

LB 培養(yǎng)基、MH 培養(yǎng)基、氨芐青霉素（100 mg/mL）、卡那霉素（50 mg/mL）、氯霉素（50 mg/mL）購自北京索萊寶科技有限公司；限制性內切酶DpnI 購自Promega公司；2 000 bp DNA Marker、250 bp DNA Ladder Marker、Primer STAR Max Premix（2×）、質粒小提試劑盒、DNA純化試劑盒及膠回收試劑盒均購TaKaRa 公司；pEASY?-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit 購自Transgen Biotech 公司。

1.2 引物設計與合成 根據GenBank 登錄的鼠傷寒沙門氏菌arcB基因序列（SL1344_RS17190），利用Primer 5.0軟件設計特異性鑒定引物、arcB基因敲除引物、回復引物以及點突變引物。其中arcB-F/arcB-R為鑒定引物，用于鑒定arcB基因缺失株；arcB-H1P1/arcB-H2P2 為敲除引物（H1、H2 代表arcB基因上下游各45 bp的同源臂；P1、P2代表kan+基因通用引物）用于擴增含arcB基因同源臂的kan+基因片段；引物k2/kt用于檢測插入的kan+基因；引物arcB-F/kt 和k2/arcBR 用于檢測kan+基因插入的位置。利用Primer 5.0 軟件篩選arcB基因中不含且切割效率高的限制性內切酶，設計回復株引物arcB-EcoR I-F/arcB-BamH I-R。引物均由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成，引物序列見表1。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 重組菌pKD46/CVCC541 的構建及其感受態(tài)細胞的制備 將溫度敏感性質粒pKD46電轉至CVCC541菌株中，構建重組菌株。將該菌于30 ℃搖床培養(yǎng)至OD600nm為0.2 左右時，加入終濃度為30 mmol/L 的L-阿拉伯糖，誘導pKD46/CVCC541 菌株中重組輔助蛋白Gam、Beta 和Exo 的表達，當菌液電轉OD600nm為0.6左右時，立即冰浴30 min，隨后離心收集菌體，按照常規(guī)方法制備pKD46/CVCC541 感受態(tài)細胞[9]。

1.4arcB基因缺失株的構建與鑒定 以pKD4 為模板，利用敲除引物arcB-H1P1/arcB-H2P2 PCR 擴增含kan+的arcB-pKD4 片段，經DpnI 酶切消除模板pKD4 的干擾，膠回收后電轉入pKD46/CVCC541 感受態(tài)細胞中，在Gam、Beta 和Exo 3 個λ 噬菌體重組酶作用下發(fā)生同源重組，重組產物CVCC541ΔarcB::kan經引物arcB-F/R、arcB-F/kt、k2/arcB-R、k2/kt鑒定后，將其制備成感受態(tài)細胞，將溫度敏感型質粒pCP20 電轉入該重組菌中，利用質粒pCP20 中的FLP 重組酶消除kan+基因，通過含氯霉素抗性LB 平板篩選陽性克隆，通過PCR 鑒定后劃線于LB 平板上純化，最后利用arcB-F/R 引物經PCR 和測序鑒定后將其命名為CVCC541ΔarcB。

1.5arcB基因回復株的構建與鑒定 以CVCC541 基因組為模板，將基因arcB的完整ORF 及上游423 bp、下游543 bp 的序列利用回復引物arcB-EcoR I-F/arcB-BamH I-R PCR 擴增后回收純化酶切，克隆至pSTV28 載體中構建重組表達質粒pSTV28-arcB，測序鑒定后將正確的pSTV28-arcB重組質粒電轉入CVCC541ΔarcB感受態(tài)細胞中，同時將質粒pSTV28也電轉入CVCC541ΔarcB感受態(tài)細胞中，在后續(xù)實驗中作為質粒空白對照，以消除質粒對實驗結果的影響。隨后在含氯霉素的LB 平板上篩選陽性克隆，利用引物RV-M/M13-47 和arcB-F/R 分別對上述構建的重組菌經PCR 和測序鑒定，將鑒定正確的菌株分別命名為CVCC541ΔarcB/parcB、pSTV28/CVCC541 ΔarcB。

1.6arcB基因點突變株的構建與鑒定 本實驗利用無縫克隆和重組技術構建arcB基因點突變株。將arcB基因的關鍵位點His292、Asp576、His717突變成丙氨酸（Ala）。以CVCC541基因組為模板，利用點突變引物arcB-pSTV28-F1/arcBHis292-R1、arcBHis292-F2/arcBpSTV28-R2 PCR 擴增含質粒pSTV28BamH I 酶切末端同源片段和含His292Ala 點突變位點的arcB基因片段（片段1 和片段2）；引物arcB-pSTV28-F1/arc?BAsp576-R1、arcBAsp576-F2/arcB-pSTV28-R2 PCR 擴增含質粒pSTV28BamH I 酶切末端同源片段和含Asp576Ala 點突變位點的arcB基因片段（片段1 和片段2）；引物arcB-pSTV28-F1/arcBHis717-R1、arcBHis717-F2/arcB-pSTV28-R2 PCR 擴增含 質粒pSTV28BamH I 酶切末端同源片段和含His717Ala 點突變位點的arcB基因片段（片段1 和片段2）。將上述擴增的片段1 和片段2 經膠回收后通過多片段體外同源重組方法[10]連接到經BamH I 酶切后的質粒pSTV28 中，構建各點突 變 質 粒pSTV28-arcBHis-292-Ala、pSTV28-arcBAsp-576-Ala、pSTV28-arcBHis-717-Ala，各質粒經PCR 和測序鑒定正確后將其分別電轉入CVCC541ΔarcB感受態(tài)細胞中，在含氯霉素的LB 平板上篩選陽性克隆，利用引物RV-M/M13-47 和arcB-F/R 經PCR 鑒定后，將鑒定正確的重組菌株命名為arcBHis-292-Ala、arcBAsp-576-Ala、ar?cBHis-717-Ala。

1.7 各菌株生長曲線的測定 參照文獻[11]，挑取

CVCC541、 CVCC541ΔarcB、 CVCC541ΔaarcB/parcB、

arcBHis-292-Ala、arcBAsp-576-Ala及arcBHis-717-Ala菌株單克隆至LB 培養(yǎng)基中，37 ℃200 r/min 培養(yǎng)，每小時取樣一次，每次設置3 個重復，連續(xù)測定14 h 內細菌的OD600nm值，記錄結果并繪制各菌株生長曲線。生長曲線試驗重復3 次。

1.8 各菌株最小抑菌濃度（MIC）的測定 參照微量稀釋法進行各菌株藥物敏感性測定和結果判定[12]。測定菌株CVCC541、CVCC541ΔarcB對β-內酰胺類、氨基糖苷類、大環(huán)內酯類、四環(huán)素類、氯霉素類抗生素的MIC；測定親本株CVCC541、缺失株CVCC541ΔarcB、回復株CVCC541ΔarcB/parcB及點突變株arcBHis-292-Ala、arcBAsp-576-Ala、arcBHis-717-Ala對氨基糖苷類抗生素的MIC 值。在96 孔板每孔中加入100 μL MH 培養(yǎng)基，然后在第一孔中加入100 μL 抗生素（512 μg/mL），依次2 倍倍比稀釋至第10 孔，第11孔加入100 μL MH 培養(yǎng)基作為陰性對照，第12 孔加入100 μL 菌液作為陽性對照。將制備好的菌液以每孔100 μL 加入，混勻后37 ℃培養(yǎng)16 h～18 h，觀察結果。藥敏試驗重復3 次。

2 結 果

2.1arcB基因缺失株的構建與鑒定結果 以質粒pKD4 為模板，利用引物arcB-H1P1/arcB-H2P2 經PCR 擴增出含有kan+基因的PCR 產物arcB-pKD4，將其電轉入CVCC541/pKD46 菌株中，構建重組菌株CVCC541ΔarcB::kan，利用4對引物經PCR鑒定該重組菌。結果顯示，分別獲得大小為2 007 bp、1 378 bp、1 100 bp、471 bp 的重組片段（圖1A），而親本菌株擴增出了2 865 bp 的arcB基因片段，表明正確構建了重組菌株CVCC541ΔarcB::kan；將其電轉化pCP20質粒中構建arcB基因缺失株CVCC541ΔarcB，利用arcB-F/R 引物對其經PCR 鑒定，結果顯示該菌株擴增出約為591 bp 的目的條帶（圖1B），測序結果顯示擴增序列正確且被kan+基因替換的arcB基因已去除，表明正確構建缺失株CVCC541ΔarcB。

2.2arcB基因回復株CVCC541ΔarcB的構建與鑒定結果 將含arcB基因的完整ORF 及上游423 bp、下游543 bp 序列的回復株采用2 對引物分別經PCR鑒定。結果顯示，利用引物RV-M/M13-47 擴增出3 033 bp 的兩端含有酶切位點的arcB基因片段；利用引物arcB-F/R 擴增的2865 bp 的arcB基因片段和591 bp的arcB基因缺失片段，與預期結果一致（圖2），同時利用引物RV-M/M13-47 鑒定質粒pSTV28 電轉入CVCC541ΔarcB的重組菌株，擴增出150 bp 的質粒片段（圖略），測序結果顯示擴增序列正確。表明正確構建回復株CVCC541ΔarcB/parcB及質粒對照菌株pSTV28/CVCC541ΔarcB。

2.3arcB基因點突變株的構建與鑒定結果 以CVCC541 基因組為模板，利用點突變引物arcBpSTV28-F1/arcBHis292-R1、arcBHis292-F2/arcB-pSTV28-R2分別擴增出大小為1 438 bp、1 720 bp的arcBHis-292-Ala片段1 和片段2；利用引物arcB-pSTV28-F1/arc?BAsp576-R1、arcBAsp576-F2/arcB-pSTV28-R2 分別擴增出大小為2289 bp、868 bp 的arcBAsp-576-Ala片段1 和片段2；利用引物arcB-pSTV28-F1/arcBHis717-R1、arcBHis717-F2/arcB-pSTV28-R2分別擴增出大小為2712 bp、445 bp 的arcBHis-717-Ala片段1 和片段2；將各片段1 和2 純化后一起分別克隆至經BamH I 酶切后的質粒pSTV28 中構建各突變質粒pSTV28-arcBHis-292-Ala、pSTV28-arc?BAsp-576-Ala、pSTV28-arcBHis-717-Ala。將 經PCR 和 測序 鑒定正確的各突變質粒電轉入CVCC541ΔarcB中，篩選的陽性克隆分別經2 對引物鑒定。結果顯示，利用引物RV-M/M13-47 分別從3 個突變菌株中擴增出3 303 bp 的arcB基因點突變片段；利用引物arcBF/R 分別從3 個突變菌株中擴增出2 865 bp 的arcB基因點突變片段和591 bp 的arcB基因缺失片段，均與預期一致（圖3），測序結果顯示擴增序列正確。表明正確構建點突變株arcBHis-292-Ala、arcBAsp-576-Ala、arcBHis-717-Ala。

圖3 各arcB 基因點突變菌株的PCR 鑒定結果Fig. 3 PCR identification results of each arcB gene point mutation strain

2.4 各菌株生長曲線的測定結果 測定了親本株、缺失株、回復株及arcB基因點突變株在14 h 內的OD600nm值，繪制生長曲線。結果顯示，缺失株CVCC541 ΔarcB及點突變株arcBHis-292-Ala、arcBAsp-576-Ala、arcBHis-717-Ala生長速度較親本株CVCC541 變慢，在最初的0～2 h內，缺失株及點突變株與親本株的生長速率大致相同，在3 h～6 h 內，缺失株與點突變株的生長速率有所下降，在7 h～14 h 內，缺失株與點突變株的生長速率與親本株趨于一致；而回復株生長速率恢復，與親本株一致（圖4）。表明arcB基因缺失和其關鍵位點突變后使CVCC541 菌株的生長速率變慢，arcB基因或者其關鍵位點可能對鼠傷寒沙門氏菌的生長代謝有一定的影響。

圖4 各菌株的生長曲線Fig. 4 Growth curve of each strain

2.5 各菌株藥敏試驗結果

2.5.1 親本株和arcB基因缺失株對各類抗生素的MIC 測定結果 利用微量肉湯稀釋法測定親本株和arcB基因缺失株對各類抗生素的MIC。結果顯示，與親本株相比，arcB基因缺失株對β-內酰胺類、大環(huán)內酯類、四環(huán)素類、氯霉素類抗生素的敏感性無變化，但對氨基糖苷類鏈霉素、阿米卡星、慶大霉素的耐藥性分別增加16、8、4 倍（表2），表明arcB基因主要影響鼠傷寒沙門氏菌對氨基糖苷類抗生素的敏感性，使其對這類抗生素的耐藥性均增加。

2.5.2 各菌株對氨基糖苷類抗生素的MIC 測定結果

根據第一次藥敏試驗結果，利用微量肉湯稀釋法進一步測定各菌株對氨基糖苷類抗生素的MIC。結果顯示，缺失株CVCC541ΔarcB對氨基糖苷類藥物敏感性均有不同程度的降低，對鏈霉素、妥布霉素、慶大霉素的耐藥性增加8 倍，對阿米卡星、新霉素、奈替米星、卡那霉素的耐藥性增加4 倍，對大觀霉素的耐藥性未發(fā)生變化，而回復株則表現出與親本株相似的藥物敏感性，質粒對照菌株pSTV28/CVCC541ΔarcB對抗生素的敏感性與arcB基因缺失株一致，表明質粒pSTV28 對藥物試驗結果無影響；各arcB基因點突變株與arcB基因缺失株藥物敏感性一致（表3）。表明ArcB 關鍵位點影響其介導的鼠傷寒沙門氏菌CVCC541 對氨基糖苷類藥物的耐藥性。

表2 親本株和缺失株對5 類抗生素的MIC 測定結果Table 2 MIC determination results of the parental strain and the deleted strain against 5 types of antibiotics

表3 各菌株對氨基糖苷類抗生素的MIC 測定結果Table 3 MIC determination results of various strains for aminoglycoside antibiotics

3 討 論

本研究通過Red 同源重組技術構建了arcB基因缺失株和arcB基因回復株，并通過無縫克隆和重組技術構建3 株arcB基因關鍵位點點突變株，檢測了各菌株的體外生長速率及對抗菌藥物的敏感性。Red 同源重組技術已普遍應用于大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌及銅綠假單孢桿菌等多種微生物中[13]，但其在實際操作中因菌株差異而使得敲除條件有所不同。參照文獻[14]，本實驗在同源片段的長度、L-阿拉伯糖的濃度及誘導時間、感受態(tài)細胞的狀態(tài)及濃度以及電轉條件等方面進行了試驗。文獻報道的大腸桿菌arcB基因的同源臂長度為56 nt，本實驗所用鼠傷寒沙門氏菌arcB基因的同源臂長度為45 nt，這樣不僅重組效率高還節(jié)省了引物合成成本；該研究報道的用于誘導pKD46 質粒3 個重組蛋白表達的L-阿拉伯糖的濃度為100 mmol/L，誘導時間為90 min，本實驗通過設置不同濃度（30 mmol/L、50 mmol/L、70 mmol/L、100 mmol/L）的L-阿拉伯糖誘導重組菌3 個重組蛋白的表達，通過電轉后陽性克隆的轉化效率最終確定了重組菌pKD46/CVCC541 最佳誘導濃度為30 mmol/L。當菌液OD600nm為0.6 時，制備該重組菌的感受態(tài)細胞最佳。因此確定誘導pKD46/CVCC541 重組菌中3 個重組蛋白表達的最佳誘導時間為1 h。還通過試驗確定了將pKD46 電轉化至CVCC541 菌中的最佳電轉條件為2.3 kv，2.5 ms。

生長曲線結果顯示arcB基因缺失和其關鍵位點突變變后使得CVCC541 菌株生長速率變慢，影響了其體外生長。當缺失arcB基因后，可能影響了arcB基因調控的下游響應調節(jié)因子arcA 的磷酸化，使得ArcAB 系統信號轉導通路中斷[15]。而His292、Asp576、His7173 個位點是arcB基因關鍵的功能位點，突變這3 個位點后，使得arcB基因自磷酸化和調節(jié)ArcA 的磷酸化功能喪失[5]，因而產生了與缺失arcB基因后的重組菌生長變慢的一致結果。因此，缺失arcB基因或點突變arcB基因關鍵位點后其生長受影響，可能的作用機制是該缺失或突變直接或間接影響了ArcAB 系統的信號轉導，從而影響了與重組菌生長相關的基因的表達。

藥敏試驗結果表明缺失arcB基因后，缺失株對氨基糖苷類抗生素抗性有不同程度的提高，但對其他類抗生素的敏感性無影響。研究表明大腸桿菌生物被膜形成和雙組分系統（TCS）信號轉導均增加了該菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性[16-17]。細菌對氨基糖苷類藥物耐藥機制主要與其外膜蛋白改變、藥物核糖體靶標修飾、氨基糖苷鈍化酶的修飾及外排泵等相關[18]。而目前外排泵已經成為抗生素耐藥性的決定因素，其過表達后可導致細菌產生多重耐藥性[19]。已知ArcAB 系統在能量代謝和呼吸控制方面具有重要作用[4]，而細菌體內外排泵需要消耗能量將抗生素及有害物質等排出體外，從而使細菌產生耐藥性。因此可推測ArcAB 雙組分系統對鼠傷寒沙門氏菌氨基糖苷類抗生素耐藥性調控可能與其對能量代謝的調控相關。

Arc雙組分系統中的arcB基因點突變株arcBHis-292-Ala、arcBAsp-576-Ala、arcBHis-717-Ala對氨基糖苷類抗生素的耐藥性增加，與arcB基因缺失株對氨基糖苷類藥物抗性增加結果一致。近些年對arcB基因結構的研究已取得很大進展，通過對其結構的解析明確了arcB基因中的關鍵作用位點，為其功能的研究提供了理論支持。研究表明His292、Asp576、His717位點是arcB自身磷酸化途徑所必需的，且His292是arcB基因自動磷酸化的位點[5]。這些功能位點的缺失與arcB基因缺失對鼠傷寒沙門氏菌氨基糖苷類藥物耐藥性調控產生的結果一致，進一步證實了His292、Asp576、His717位點對arcB基因功能的重要性，也表明arcB基因對氨基糖苷類藥物耐藥性調控可能與其磷酸化狀態(tài)相關。

雖然不同雙組分系統之間可能存在相互串擾作用[16,20]，進而對鼠傷寒沙門氏菌的生物學特性產生影響，但與arcB基因缺失株和該基因點突變株相比，回復株對氨基糖苷類抗生素的藥物敏感性恢復，與親本株一致，表明arcB基因突變導致的鼠傷寒沙門氏菌藥物敏感性的變化確實是由該基因引起的。目前對ArcAB 系統的研究主要集中在其對細菌的能量代謝及呼吸控制方面，而對其耐藥性的相關作用的研究較少。通過本實驗可認為arcB基因確實通過某種未知的機制調控鼠傷寒沙門氏菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥性，但具體機制還需進一步試驗探究。綜上所述，本研究結果表明，arcB基因參與鼠傷寒沙門氏菌對氨基糖苷類抗生素耐藥性的調控，不只是以往文獻報道的與該菌的能量或呼吸代謝相關。因此，本實驗為arcB基因的生物學功能提供了一個新的研究方向。