Sec62/Sec63 復(fù)合物對乙型腦炎病毒在HEK-293 細胞中復(fù)制影響的研究

王 晗，劉 靖，鐘 杰，步志高，華榮虹

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069）

蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER）膜中的轉(zhuǎn)運是真核細胞中高度保守的生物過程，對許多跨膜蛋白和大多數(shù)分泌蛋白的生物合成至關(guān)重要，該過程可分為3 個主要步驟：將新合成的前體蛋白或新生多肽鏈靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜；將蛋白質(zhì)插入多肽傳導(dǎo)通道；以及跨膜蛋白從通道向磷脂雙層的橫向釋放或轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)。在真核細胞中，分泌蛋白的新生多肽鏈通過共翻譯轉(zhuǎn)運或者翻譯后轉(zhuǎn)運方式至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，通過Sec61 復(fù)合物進行跨膜轉(zhuǎn)運[1]。在該轉(zhuǎn)運過程中，另一位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中的異二聚體復(fù)合物（Sec62/Sec63）在某些蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運過程中也起著重要作用[2]。文獻報道，Sec62 是位于ER 上的跨膜蛋白，主要功能是同Sec63 一起，與Sec61 復(fù)合物相互作用于核糖體，協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)翻譯，輔助蛋白質(zhì)易位，并可進一步影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endo?plasmic reticulum stress，ERS）誘導(dǎo)的細胞反應(yīng)。沉默SEC62 能夠抑制含信號肽的前體蛋白的翻譯后轉(zhuǎn)運[3]。Sec63 蛋白由3 個跨膜結(jié)構(gòu)域組成，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)J結(jié)構(gòu)域與分子伴侶Bip（Binding protein）相互作用，促進前體蛋白通過Sec61 通道進行易位[4]。有研究報道，PrP（Prion protein）和ppcecA（Presecretory protein preprocecropin A）依賴于Sec63 插入到Sec61 通道，因此Sec63 蛋白可以特異性影響部分多聚體蛋白的合成[5]。

流行性乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis vi?rus，JEV）是一種蚊媒性人獸共患病病原，屬黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）。JEV 通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞和轉(zhuǎn)運進入細胞內(nèi)吞體，內(nèi)吞體內(nèi)部酸性環(huán)境使病毒囊膜糖蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，誘導(dǎo)病毒囊膜與內(nèi)吞體膜發(fā)生融合，釋放病毒基因組[6]。ER 是JEV 復(fù)制周期中的重要場所，也是膜蛋白的合成、轉(zhuǎn)運和加工修飾場所，prM 與E 蛋白的合成和轉(zhuǎn)運可能與ER 常駐蛋白有關(guān)[7]。有研究表明口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth disease virus，F(xiàn)MDV）感染BHK-21 細胞后，細胞內(nèi)Sec62 表達上調(diào)；沉默Sec62基因后，則抑制FMDV 復(fù)制[8]。還有研究發(fā)現(xiàn)牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）在感染細胞中Sec62 的表達上調(diào)可能有助于病毒糖蛋白在感染后期向ER 轉(zhuǎn)移[9]。Sec62 與Sec63等宿主因子在JEV 復(fù)制過程中的作用與機制目前還不清楚。

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palin?dromic repeats）/Cas 是細菌和古細菌用來抵御噬菌體感染和躲避哺乳動物免疫反應(yīng)的獲得性免疫系統(tǒng)[10]，其中CRISPR/Cas9 技術(shù)已經(jīng)發(fā)展為高效的基因打靶工具而得到廣泛運用，可以作為一種新型高效的基因編輯工具，對內(nèi)源基因DNA 序列進行靶向刪除、插入或修飾[11]。為了研究Sec62、Sec63 等宿主因子對JEV 復(fù)制的影響，本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了SEC62、SEC63基因敲除的細胞系，分析了SEC62、SEC63基因敲除后對JEV 的感染效率、病毒蛋白表達水平以及病毒復(fù)制效價的影響，為進一步研究Sec62、Sec63 等宿主因子對JEV 復(fù)制影響機制提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 HEK-293 細胞、BHK-21 細胞、pSpCas9（BB）-2A-GFP（PX458）載體均由本實驗室保存；DMEM、胎牛血清、0.05%胰酶購自Gibco公司；BbsI 酶、T4 連接酶購自NEB 公司；pMD19-T載體、Ex Taq酶購自寶生物工程（大連）有限公司；GAPDH 抗體購自Proteintech 公司；抗JEV E 蛋白單克隆抗體（MAb）由本實驗室制備；兔源抗Sec62 多克隆抗體購自Abcam 公司；Triton X-100 購自Sigma公司；Albumin Bovine V 購自Biotopped 公司；FITC標記的山羊抗小鼠IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Hoechst 33342、LipofectamineTMLTX Re?agent 轉(zhuǎn)染試劑、紅外熒光（RDye 680CW）標記驢抗鼠IgG 購自Thermo 公司；紅外熒光（RDye 800CW）標記驢抗兔熒光二抗購自LI-COR 公司；NP-40 裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞、ClonExpress II One Step Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega 公司；基因組DNA 提取試劑盒購自Tiangen公司；sgRNA 與PCR 引物由哈爾濱睿博興科生物技術(shù)公司合成。

1.2SEC62、SEC63基因敲除HEK-293 細胞系的建立

1.2.1 sgRNA 的設(shè)計與合成 參考人類SEC62（NM_003262.3）與SEC63（NM_007214）基因序列，利用網(wǎng)絡(luò)在線工具（www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.ht?ml）進行sgRNA 設(shè)計。針對SEC62基因選取其204 bp位置的sgRNA，對應(yīng)的正鏈編碼寡核苷酸序列為SEC62-gRNA-A，其互補鏈名稱為SEC62-gRNA-B。針對SEC63基因選取410 bp 位置的sgRNA，對應(yīng)的編碼寡核苷酸序列命名為SEC63-gRNA-A，互補鏈為SEC63-gRNA-B。寡核苷酸序列如表1 所示，寡核苷酸由哈爾濱睿博興科生物技術(shù)公司合成。

1.2.2 sgRNA 表達質(zhì)粒的構(gòu)建 將pSpCas9（BB）-2A-GFP（PX458）載體經(jīng)BbsI 酶切，回收線性化的PX458 載體。將合成的sgRNA 寡核苷酸進行退火處理，反應(yīng)體系為SEC62-gRNA-A（100 μmol/L）1 μL，SEC62-gRNA-B（100 μmol/L）1 μL，T4 PNK 1 μL，T4 buffer 1 μL，H2O 4 μL。95 ℃3 min 后，自然冷卻20 min（SEC63sgRNA 寡核苷酸的退火體系與反應(yīng)條件同上）。將退火后的雙鏈DNA 與線性化后的PX458 載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞，挑取單克隆菌落培養(yǎng)后由睿博興科公司測序，將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒分別命名為pSec62-sgRNA 與pSec63-sgRNA，提取質(zhì)粒后使用超微量分光光度計測定濃度。

表1 編碼SEC62、SEC63 基因sgRNA 寡核苷酸序列Table 1 The oligo DNA sequence encoding of sgRNA of SEC62, SEC63

1.2.3SEC62、SEC63基因敲除細胞的克隆篩選待6 孔板中HEK-293 細胞匯合度達80%時，利用LipofectamineTMLTX Reagent 試 劑 分 別 轉(zhuǎn) 染2.5 μg pSec62-sgRNA 與pSec63-sgRNA。轉(zhuǎn) 染48 h 后棄 去細胞培養(yǎng)液，胰酶消化，將細胞懸液加入流式細胞術(shù)上樣管中，利用MoFlo XDP 超速流式細胞分選系統(tǒng)將綠色熒光陽性細胞分選至含有20%胎牛血清的DMEM 液的96 孔板中，置37 ℃培養(yǎng)5 d～6 d 后觀察、標記和換液，待細胞生長密度達70%時將細胞消化轉(zhuǎn)至24 孔板培養(yǎng)，后逐漸擴大至細胞培養(yǎng)瓶中。

1.2.4 基因敲除細胞系的測序鑒定 將上述克隆細胞消化分散，離心后提取細胞基因組DNA，在靶sgRNA位點兩端設(shè)計引物，命名為SEC62-1s/SEC62-2a、SEC63-1s/SEC63-2a（表2），分別經(jīng)PCR擴增SEC62和SEC63基因，同時以HEK-293細胞作為對照。反應(yīng)程序為：94 ℃5 min；94 ℃30 s、50 ℃30 s、72 ℃40 s，35 個循環(huán)；72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物由哈爾濱睿博興科生物技術(shù)公司測序，將測序結(jié)果與基因序列比較分析，將鑒定陽性的細胞克隆分別命名為SEC62KO HEK-293、SEC63KO HEK-293 細胞。

1.2.5 基因敲除細胞系的western blot 鑒定 將HEK-293 細胞與SEC62KO HEK-293 細胞傳代至10代，PBS洗滌后1 000 r/min，離心5 min棄去上清，加入100 μL 含蛋白酶抑制劑的NP-40 裂解液，4 ℃裂解1 h，10 000 r/min 離心5 min，取10 μL，以兔抗Sec62蛋白抗體（1 1 000）及鼠抗GAPDH 抗體（1 5 000）為一抗，以紅外熒光（RDye 800CW）標記的驢抗兔IgG（1 10 000）及紅外熒光（RDye 80CW）標記的驢抗鼠IgG（1 10 000）為二抗，經(jīng)western blot 檢測，SEC62KO HEK-293 細胞系中Sec62 蛋白的敲除效果，并以野生型HEK-293 細胞作為對照。

表2 擴增目的基因的PCR 引物Table 2 Primers for target segments amplification

1.3SEC62、SEC63基因敲除對JEV 復(fù)制的影響 分別將HEK-293、SEC62KO HEK-293、SEC63KO HEK-293 細胞接種于24 孔板中，置37 ℃培養(yǎng)24 h，分別以MOI 為1、0.05 的JEV 感染上述細胞。感染48 h 后棄去細胞培養(yǎng)液，以鼠抗JEV E 蛋白MAb 為一抗，以Alexa Fluor?488 標記的山羊抗小鼠IgG（1 150）為二抗， Hoechst 33342（1 10 000）室溫染細胞核，利用間接免疫熒光試驗（IFA）檢測SEC62、SEC63基因敲除對JEV 復(fù)制的影響。

1.4SEC62、SEC63基因敲除對JEV E 蛋白表達影響的檢測 分別將HEK-293、SEC62KO HEK-293、SEC63KO HEK-293 細胞接種于24 孔板中，置37 ℃培養(yǎng)24 h 后，將JEV 以MOI=1 分別感染上述細胞，且設(shè)置未感染對照組。于感染后12 h、24 h、48 h 收集并裂解細胞，對照組于48 h 收集細胞，10 000 r/min 離心5 min，取裂解上清液制備電泳蛋白樣品，分別以鼠抗JEV E 蛋白抗體及GAPDH 抗體（1 5 000）為一抗，以紅外熒光（RDye 680CW）標記的驢抗鼠IgG（1 10 000）及紅外熒光（RDye 800CW）標記的驢抗兔IgG（1 10 000）為二抗，利用western blot 檢測JEV E 蛋白的表達。

1.5SEC62、SEC63基因敲除對JEV 子代病毒影響 將HEK-293、SEC62KO HEK-293、SEC63KO HEK-293 細胞于24 孔板中37 ℃培養(yǎng)24 h，將JEV以MOI=1 感染上述細胞，于感染后12 h、24 h、48 h 收集細胞培養(yǎng)液，以DMEM 10 倍倍比稀釋后以100 μL/孔接種于37 ℃培養(yǎng)24 h 后的BHK-21 細胞，按常規(guī)方法測定上清液中子代病毒滴度；進一步以MOI 為1、0.5、0.05 梯度感染HEK-293、SEC62KO HEK-293、SEC63KO HEK-293，于48 h 收集細胞上清，以上述方法進行稀釋和檢測。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pSec62-sgRNA 和pSec63-sgRNA 的構(gòu)建與鑒定結(jié)果 將退火得到的雙鏈DNA 克隆至PX458 載 體， 構(gòu) 建 重 組 質(zhì) 粒pSec62-sgRNA 和pSec63-sgRNA，經(jīng)測序鑒定后顯示已正確構(gòu)建含有編碼目的sgRNA 序列的重組質(zhì)粒。質(zhì)粒模式圖如圖1 所示。

圖1 pSec62-sgRNA 和pSec63-sgRNA 質(zhì)粒模式圖Fig. 1 Schematic diagram of the pSec62-sgRNA and pSec63-sgRNA

2.2 基因敲除細胞系的鑒定

2.2.1 基因敲除細胞系靶基因序列檢測結(jié)果 提取SEC62KO HEK-293 細 胞、SEC63KO HEK-293 細 胞及HEK-293 細胞基因組，采用表2 中引物，以基因組為模板進行PCR 擴增，對擴增產(chǎn)物進行測序分析。結(jié)果顯示，與人SEC62基因序列進行比對，SEC62KO HEK-293 細胞中SEC62基因缺失2 bp，導(dǎo)致缺失序列后第5 個密碼子突變?yōu)榻K止子，另一編輯方式為缺失19 bp 序列；與人SEC63基因序列比對后結(jié)果表明，SEC63KO HEK-293 細胞中SEC63基因分別發(fā)生缺失4 bp 與缺失1 bp 兩種突變，均導(dǎo)致在缺失突變后立即出現(xiàn)終止密碼子。序列測定結(jié)果均顯示所構(gòu)建的細胞系目的基因SEC62和SEC63分別發(fā)生了缺失性突變（圖2）。表明正確構(gòu)建SEC62基因敲除細胞系和SEC63基因敲除細胞系。

2.2.2SEC62KO HEK-293 細 胞 的western blot 鑒 定結(jié)果 Western blot 方法檢測SEC62KO HEK-293 細胞與HEK-293 細胞中Sec62 蛋白的表達情況。結(jié)果顯示野生型HEK-293 細胞中Sec62 蛋白（45.8 ku）正常表達，而未能檢測到SEC62KO HEK-293 細胞中該蛋白條帶（圖3），表明SEC62KO HEK-293 細胞中SEC62基因發(fā)生了缺失，SEC62KO HEK-293 細胞已正確構(gòu)建。

圖2 基因編輯HEK293 細胞中SEC62、SEC63 等位基因的序列測定Fig. 2 Sequencing of SEC62, SEC63 alleles in gene-edited HEK293 cells

圖3 SEC62 KO HEK-293 細胞的western blot 鑒定Fig. 3 Western blot analysis of SEC62 KO HEK-293 cells

2.3SEC62、SEC63基因敲除影響JEV 的復(fù)制 將

JEV（MOI 為1、0.05）分別感染HEK-293 和SEC62、SEC63基因敲除細胞系后48 h，利用IFA 檢測JEV 復(fù)制情況，結(jié)果顯示，以不同劑量的JEV 感染細胞后，SEC62KO HEK-293 和SEC63KO HEK-293 細 胞內(nèi)的熒光陽性細胞均少于HEK-293 細胞對照組，且熒光隨著病毒感染劑量的減小而減少，并且SEC63KO HEK-293 細胞組熒光信號陽性細胞少于SEC62KO HEK-293 細胞的熒光信號陽性細胞（圖4）。表明SEC62、SEC63基因缺失后JEV 的復(fù)制效率降低，而且SEC63基因缺失后對JEV 復(fù)制的抑制作用強于SEC62。

圖4 JEV 復(fù)制的IFA 檢測Fig. 4 Detecting JEV replication by indirect immunofluorescence test

2.4SEC62、SEC63基因敲除影響JEV E 蛋白的表達 將MOI 為1 的JEV 分別感染HEK-293、SEC62KO HEK-293、SEC63KO HEK-293 細胞后12 h、24 h和48 h，裂解細胞經(jīng)western blot 檢測JEV E 蛋白表達情況。結(jié)果顯示感染后12 h、24 h 和48 hSEC62KO HEK-293 細胞 和SEC63KO HEK-293 細 胞 中均檢測不到JEV E 蛋白的表達；但在HEK-293 細胞中于感染后24 h、48 h 均可檢測到該蛋白，且JEV E蛋白表達量隨感染時間的延長而逐漸增多；未接毒對照未檢測出目的條帶（圖5）。結(jié)果表明SEC62、SEC63基因缺失后抑制JEV E 蛋白表達。

2.5SEC62、SEC63基因敲除對JEV 滴度的影響以MOI 為1 的JEV 感染HEK-293 細胞、SEC62KO HEK-293 細胞和SEC63KO HEK-293 細胞，培養(yǎng)液經(jīng)病毒滴度測定，結(jié)果顯示在感染后12 h，SEC62KO HEK-293、SEC63KO HEK-293 和HEK-293 細胞上清中的病毒滴度經(jīng)檢驗，差異不顯著（p>0.05）；感染后24 h，SEC62KO HEK-293、SEC63KO HEK-293 上清病毒滴度降低，與野生型相比差異顯著（p<0.01）；感染后48 h，SEC62KO HEK-293、SEC63KO HEK-293 上清病毒滴度明顯降低，與野生型相比差異極顯著（圖6A）。表明SEC62、SEC63基因缺失后影響上清中子代病毒的產(chǎn)生。

分別以不同劑量JEV 感染HEK-293、SEC62KO HEK-293 和SEC63KO HEK-293 細 胞，48 h 時 檢 測病毒滴度，結(jié)果顯示不同感染劑量下，SEC62KO HEK-293 細胞、SEC63KO HEK-293 細胞和HEK-293 細胞上清液中病毒滴度經(jīng)檢驗，MOI 為1、0.5、0.05 時，SEC62KO HEK-293、SEC63KO HEK-293上清病毒滴度與HEK-293 中上清相比差異極顯著（p<0.01）。在不同劑量感染下基因敲除細胞組與對照組病毒效價差異均為極顯著（圖6B）。進一步證明SEC62、SEC63基因敲除影響JEV 的復(fù)制效率。

圖6 基因敲除細胞系對JEV 病毒滴度的影響Fig. 6 The effect of SEC62 and SEC63 knockout on JEV titers

3 討 論

研究表明，JEV 的復(fù)制過程中，不僅需要病毒自身基因組表達的蛋白參與，還需要大量的宿主表達的蛋白的參與[12]。因此研究宿主因子對JEV 復(fù)制的影響有助于了解JEV 復(fù)制機制與致病機理，進而為抗病毒治療提供新方法。

有研究表明Sec62 可以與核糖體相互作用，從而調(diào)節(jié)翻譯[13-14]。Sec62 蛋白可能參與蛋白質(zhì)于ER易位的早期階段[15]。Sec63 蛋白與Bip 相互作用，可控制蛋白質(zhì)在ER 中易位的方向[16]。ER 為JEV 復(fù)制的重要場所，探究ER 相關(guān)宿主因子對JEV 復(fù)制的影響有助于理解JEV 的致病機理。Sec62/Sec63 復(fù)合物作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯和易位，但其對于JEV 的復(fù)制的影響尚不明確。為了解其是否為JEV 的復(fù)制相關(guān)宿主因子及其對復(fù)制的影響，進而研究JEV 致病機理，本實驗將HEK-293 細胞中的SEC62和SEC63分別敲除后感染JEV 研究其對JEV 復(fù)制的影響。

由于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是一種高效、方便的基因編輯工具，且操作簡單、基因修飾率高、可遺傳和實驗成本低[17]，本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)成功建立SEC62、SEC63基因敲除的HEK-293 細胞系，為進一步研究SEC62、SEC63基因?qū)EV 的影響奠定基礎(chǔ)。等位基因存在兩種編輯方式，但其通過移碼突變以及提前終止的形式均影響了目的蛋白的表達。因HEK-293 細胞中Sec63 蛋白表達水平較低，本實驗所選用Sec63 抗體無法檢測HEK-293 細胞中的Sec63 蛋白，所以未能通過western blot 方法鑒定SEC63KO HEK-293 細胞，但基因測序結(jié)果表明基因敲除后均發(fā)生了缺失突變，且缺失突變后立即出現(xiàn)終止子，表明所構(gòu)建的細胞系中Sec63 發(fā)生了功能突變。SEC62、SEC63基因敲除的HEK-293 細胞系的細胞活性與HEK-293 無差異。通過IFA、west?ern blot 和子代病毒滴度的測定，顯示SEC62、SEC63基因缺失后抑制JEV 蛋白的表達以及子代病毒的形成，研究結(jié)果表明SEC62與SEC63敲除后抑制了JEV 的復(fù)制，表明Sec62 和Sec63 是JEV 在細胞內(nèi)進行復(fù)制的相關(guān)宿主因子。SEC62、SEC63基因缺失可能導(dǎo)致Sec62 與Sec63 無法協(xié)同作用參與JEV 多聚蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Sec61 通道的選擇性插入過程，或者影響參與JEV 復(fù)制的其他宿主因子的易位過程，從而影響JEV 復(fù)制。其具體影響機制待進一步實驗研究。