一株新型三源重配H1N2 亞型豬流感病毒的進化分析及對小鼠的感染性研究

鐘 秋，張丹丹，宋祖晨，孟 飛，陳 艷，喬傳玲，陳化蘭，曹允考，楊煥良*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物流感重點開放實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

豬流感（Swine influenza，SI）又稱豬流行性感冒，是由正黏病毒科流感病毒屬的豬流感病毒（Swine influenza virus，SIV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病。臨床上以突發(fā)、高熱、咳嗽、呼吸困難為主要特征。SIV 感染影響患豬的生產(chǎn)性能和疫病抵抗力，極易并發(fā)或繼發(fā)其它病原微生物感染。同時，豬的呼吸道上皮細胞同時具有人和禽流感病毒的受體，因此是人和禽流感病毒的共同易感宿主，被稱為流感病毒的“混合器”[1]，對豬流感的研究具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

目前世界上流行的SIV 主要有H1N1、H1N2 和H3N2 三種亞型。1978 年，日本首次在豬群中分離到H1N2 亞型流感病毒[2]。此后世界其它地區(qū)，包括亞洲、歐洲和北美地區(qū)都分離到了這一亞型病毒[3-5]。2009 年4 月，H1N1/2009（甲型H1N1）在全球爆發(fā)后很快傳入豬群，并且和原有的SIV 發(fā)生基因重配，產(chǎn)生了多種含有H1N1/2009 基因節(jié)段的H1N2亞型SIV[9-14]。我國于2004 年開始持續(xù)在豬群中分離到不同基因節(jié)段來源組成的H1N2 亞型SIV[6-8]。調(diào)查我國SIV 在廣西豬群中的流行毒株情況時，本實驗室于廣西某豬場中采集鼻腔拭子樣品并分離到一株H1N2 亞型SIV，本研究通過對該病毒株進行全基因組的序列測定，揭示其遺傳演化關(guān)系及分子特征，并以BALB/c 小鼠為模型動物，評估病毒的致病性，為SIV的流行病學(xué)、致病性和防控研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒分離株、實驗動物及主要試劑 A/swine/Guangxi/238/2018（H1N2）株流感病毒，簡稱GX238株，為本實驗室2018 年冬季從廣西某豬場臨床健康豬200份鼻腔拭子中按照參考文獻[13]分離，經(jīng)測定其雞胚半數(shù)感染量（EID50）[14]為7.32 Log10EID50/0.1 mL，-70 ℃保存。實驗用10 日齡SPF 雞胚購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心；6 周齡的雌性BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物有限公司。

病毒RNA 提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；TaqDNA Polymerase PCR 擴增酶購自北京拓派科技有限公司；PCR 產(chǎn)物膠回收試劑盒購自美國Omega 公司；測序反應(yīng)試劑盒Big?Dye Terminator3.1 購自美國ABI 公司；所用引物由吉林庫美生物科技有限公司合成。

1.2 全基因組測序及遺傳進化分析 按照RNA 提取試劑盒說明書提取病毒RNA，以通用引物Uni12（5'-AGCAAAAGCAGG-3'）作為反轉(zhuǎn)錄引物，將病毒RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。對病毒的8 個基因節(jié)段分別用節(jié)段特異性引物擴增，引物序列及反應(yīng)程序參照文獻[13]。利用膠回收試劑盒回收、純化目的節(jié)段。

按照BigDye Terminator 測序試劑盒說明書對病毒各節(jié)段進行序列測定，并利用SeqMan 軟件進行全序列拼接。測序結(jié)果利用MegAlign 軟件進行同源性比較，并用MEGA7.0 軟件構(gòu)建HA、NA、M 和PB2等基因的系統(tǒng)進化樹。

1.3 病毒對BABL/c 小鼠的感染性試驗 將6 周齡的雌性BALB/c 小鼠隨機分為兩組，感染組的8 只BALB/c 小鼠利用干冰輕度麻醉后，以50 μL/只含有106EID50GX238 株病毒鼻腔感染；對照組5 只小鼠，采用同樣的方法接種50 μL 無菌PBS。感染后每組選取5 只實驗小鼠每日記錄小鼠的體質(zhì)量變化及死亡情況，對體質(zhì)量比例下降30%的動物實施安樂死，并判定死亡。在感染后的第3 d 取感染組剩余3 只小鼠，無菌采集腦、鼻甲、脾、腎和肺勻漿處理后接種10 日齡雞胚進行病毒滴定，分析病毒在小鼠體內(nèi)組織與臟器的復(fù)制情況。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離株全基因組序列測定及同源性分析對GX238 株病毒提取RNA，經(jīng)RT-PCR 分節(jié)段擴增后，獲得預(yù)期大小的目的條帶，對PCR 產(chǎn)物膠回收、純化進行測序，利用SeqMan 軟件對序列結(jié)果進行全基因拼接。應(yīng)用BLAST 程序?qū)ζ唇雍玫耐暾蛄羞M行比對，得到與分離株8 個節(jié)段核苷酸序列同源性最高的8 個病毒株（表1）。結(jié)果顯示HA 基因與分離自美國的A/swine/Indiana/A01943834/2016（H1N2）核苷酸相似性最高，NS 基因與A/swine/Indiana/A01727685/2015（H1N2）核苷酸相似性最高，其余節(jié)段均與A/swine/Indiana/A01812050/2015（H1N2）核苷酸相似性最高，相似性均可達98.9%以上，表明病毒可能從A/swine/Indiana/A01812050/2015（H1N2）類病毒進化而來。

表1 GenBank 中與GX238 株各基因節(jié)段開放閱讀框核苷酸序列同源性最高的病毒株Table 1 Percentage nucleotide homology of open reading frame in each gene segment of influenza viruses closely related to the viruses with the highest nucleotide identity with GX238 strain in GenBank

2.2 HA 序列及其進化分析結(jié)果 對GX238 株HA 基因進行分析，結(jié)果顯示其編碼區(qū)全長1 698 nt，共編碼565 個氨基酸。HA 蛋白由HA1 和HA2 兩部分組成，這兩個亞單位由一個堿性氨基酸R 鏈接，堿性裂解氨基酸位點為PSIQSR↓G，符合低致病性流感病毒的特征。該毒株HA 基因分別有28NST30、40NVT42、71NCS73、142NHT144、176NLS178、497NGT499和556NSS5587 個潛在糖基化位點。根文獻[6]中的5個HA蛋白抗原位點區(qū)域，包括Sa（aa128、aa156～aa160、aa162～aa167）、Sb（aa187～aa198）、Cal（aa169～aa173、aa206、aa238）、Ca2（aa140～aa145、aa224）、Cb（aa78～aa83）與同源性最高病毒株A/swine/Indiana/A01943834/2016（H1N2）進行比對，結(jié)果顯示GX238 株HA 蛋白僅在Sa 抗原位點區(qū)域呈現(xiàn)158K 的分子特征，其余各抗原位點與比對毒株完全一致。HA 基因的進化分析可以將H1N1流感病毒分為3 個大的分支，包括經(jīng)典型（Classical）H1N1 SIV、歐亞類禽型（Eurasianavian-like）H1N1 SIV、人季節(jié)性（Humanseasonal）H1N1流感病毒，H1N1/2009 分支位于Classical H1N1 大分支內(nèi)（圖1），遺傳進化分析表明GX238 株HA 基因可能來源于以A/Bris?bane/59/2007 株為代表的2009 年之前人季節(jié)性H1N1流感病毒。

圖1 A/SW/GX/238/2018(H1N2)分離株HA 基因進化樹Fig.1 The phylogenetic treeof HA gene of A/SW/GX/238/2018(H1N2)

2.3 NA 序列及其進化分析結(jié)果 對GX238 分離株NA 基因分析，結(jié)果顯示其編碼區(qū)全長1 410 nt，共編碼469 個氨基酸，共有61NKT63、70NTT72、86NWS88、93NIT95、146NDT148、234NGT2366 個潛在糖基化位點。NA基因頭部區(qū)域未發(fā)生缺失，具有275H 和295N 的分子特征，表明對奧司他韋類藥物敏感。NA 基因進化樹顯示，可以將H1N2 亞型SIV 的NA 基因劃分為兩個分支，北美-亞洲型（NorthAmerican-Asian）H1N2 和歐洲型（European）H1N2，而GX238 株NA 位于北美-亞洲分支（圖2）。

圖2 A/SW/GX/238/2018(H1N2)分離株NA 基因進化樹Fig.2 The phylogenetic tree of the NA gene of A/SW/GX/238/2018(H1N2)

2.4 內(nèi)部基因分子特征和進化分析 A 型流感病毒PB2 基因E627K 和D701N 位點的突變可以增加流感病毒對哺乳動物的致病性和病毒在哺乳動物間的傳播能力，T271A 突變能顯著增強PB2 多聚酶活性，增加對哺乳動物感染能力[15-17]。本研究對GX238 株P(guān)B2 蛋白的627 和701 位點分析顯示均未出現(xiàn)致病性增強突變，而T271A 突變，表明GX238 株有毒力增強的可能。M2 蛋白31 位為N，可能產(chǎn)生了對金剛烷胺類藥物的耐藥性[18]。GX238 株病毒內(nèi)部基因的進化結(jié)果顯示，M 基因來源于H1N1/2009 人流感病毒（圖3），PB2 基因位于北美三重配H1N2 亞型代表株SW/He?bei/10/2006（H1N2）分 支（圖4），其 它 內(nèi) 部 基 因PB1、PA、NP、NS 在進化樹中位置和PB2 基因相同，均位于SW/Hebei/10/2006（H1N2）分支內(nèi)。

圖3 A/SW/GX/238/2018(H1N2)分離株M 基因進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of the M gene of A/SW/GX/238/2018(H1N2)

圖4 A/SW/GX/238/2018(H1N2)分離株P(guān)B2 基因進化樹Fig.4 The phylogenetic tree of PB2 gene of A/SW/GX/238/2018(H1N2)

2.5 分離株對BALB/c 小鼠的感染性試驗結(jié)果

2.5.1 小鼠體質(zhì)量變化 通過鼻腔感染小鼠GX238株后第2 d 開始檢測小鼠體質(zhì)量，結(jié)果顯示小鼠體質(zhì)量從感染后第2 d 持續(xù)下降至第9 d。其中實驗組檢測的5 只小鼠中有2 只體質(zhì)量下降超過30%，對其實施安樂死，并判定為死亡；而對照組小鼠無明顯臨床癥狀，體質(zhì)量呈上升趨勢（圖5）。上述結(jié)果表明以106EID50的病毒通過鼻腔感染，該病毒對小鼠有40%的致死率。以對小鼠100%致死、部分致死和不致死為高、中和低致病性判定標(biāo)準，表明該病毒對小鼠呈現(xiàn)中等致病力。

圖5 小鼠感染分離病毒后的體質(zhì)量變化Fig.5 Body weight change of mice inoculated with the virus

2.5.2 病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制情況 病毒感染后第3 d 每組迫殺3 只小鼠，進行臟器內(nèi)病毒含量滴定。結(jié)果顯示，在腦、腎和脾中均未檢測到病毒，病毒可在小鼠肺臟和鼻甲中有效復(fù)制，病毒滴度分別達6.3 Log10EID50/mL、4.8 Log10EID50/mL（圖6，虛線為檢測限）。表明該病毒可以在呼吸道有效復(fù)制，而尚未獲得感染其它組織和器官的能力。

圖6 感染3 d 后小鼠臟器病毒滴定結(jié)果Fig. 6 Virus titration in organs of the mice at 3 days post inoculation

3 討 論

目前H1N2 亞型是我國豬群中流行SIV 的主要亞型之一，對養(yǎng)豬業(yè)造成了持續(xù)的危害。Wang 等人在疑似患豬流感病豬體內(nèi)分離到A/swine/Fujian/F1/2010（H1N2）[19]；2012 年～2016 年期間，有研究表明在浙江、廣西和遼寧分離到含有H1N1/2009 基因的基因重配H1N2 SIV，因其含有人流感病毒基因，在危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的同時，也對人類健康造成潛在的威脅[13-14]。本研究通過對GX238 株進行遺傳進化分析，發(fā)現(xiàn)其HA 基因來源于2009 年之前人季節(jié)性H1N1 流感病毒，M 基因來源于H1N1/2009 流感病毒，NA 和其他內(nèi)部基因均來源于北美三重配H1N2 SIV。由此得出GX238 株是由2009 年之前人季節(jié)性H1N1、北美三重配H1N2 和H1N1/2009 3 種不同基因型的病毒發(fā)生基因重配而形成的新型三源重配H1N2 亞型SIV。我國豬流感流行病學(xué)研究表明，2009 年之前人群流行的H1N1 流感病毒可以感染豬[20]，但沒有形成穩(wěn)定的遺傳譜系[21]。在2009 年4月之后，2009 年之前的人季節(jié)性流感病毒逐漸被H1N1/2009 大流行的病毒株取代，因此豬群也失去了感染這一類病毒的直接來源。然而在北美地區(qū)，人季節(jié)性流感病毒通過基因重配獲得了在豬群中穩(wěn)定遺傳的能力，對養(yǎng)豬業(yè)和人類健康造成了持續(xù)的威脅。通過BLAST 軟件在線分析表明GX238株8個節(jié)段和我國病毒株同源性相對較低，而與美國的2015年～2016 年期間分離的H1N2 亞型SIV 序列高度同源。以上分析表明該病毒并非由我國流行的SIV 和H1N1/2009 重配形成，推測可能是由美國輸入型病毒進化而來。由于該株病毒HA 和M 基因來源于人流感病毒，因此又增加了其感染人的可能性。在2011 年后，美國出現(xiàn)多個H1N2 亞型流感病毒感染人的病例，病毒的基因組成與該分離株相似，都具有H1N1/2009 株的M 基因[22]。致病性試驗表明該株病毒可致死小鼠，呈現(xiàn)中等致病力，對人類健康和公共衛(wèi)生安全的威脅更不可忽視。在今后的監(jiān)測工作中，仍需密切關(guān)注該類病毒在我國豬群中的分布與流行情況。本研究結(jié)果表明輸入型SIV 持續(xù)對我國豬群造成威脅，對于該亞型的SIV，是否在豬群中適應(yīng)而具有一定的流行趨勢，然后再由豬傳染給人，需要密切關(guān)注。本研究凸顯了加強進口動物及動物產(chǎn)品檢疫措施和在世界范圍內(nèi)開展豬流感監(jiān)測的必要性。